柞蚕模式识别受pgrp-a的序列分析及重组表达.pdfVIP

摘 要 昆虫的免疫系统与脊椎动物不同，它没有T细胞和B 细胞，没有脊椎动物所具 有的补体系统。尽管它没有获得性免疫系统，但是却具有可以对病原微生物做出快速 和有效应答的先天性免疫系统。肽聚糖识别蛋白（PGRP）是重要的先天性免疫基因 家族，是一种重要的模式识别受体，它可以识别微生物表面的肽聚糖（PGN)并启动 免疫反应。迄今为止，在多种昆虫和其他动物中都发现了PGRP，尽管这些PGRP在 进化过程中，结构上表现的很保守，但是在功能和表达模式方面确是不一样的。 柞蚕（Antheraeapernyi）是鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属的一种绢丝类昆虫，除了作为 纺织工业原料利用外，还有很高的药用和食用等经济价值。为了能够更全面的了解 PGRP在鳞翅目昆虫先天性免疫中的功能，本实验以柞蚕为研究对象，克隆鉴定出一 种肽聚糖识别蛋白，将其命名为PGRP-A，利用分子生物学和生物信息学方法对柞蚕 PGRP-A基因进行研究，获得的主要结果如下： 1．PGRP-A 基因的克隆及序列分析： 设计简并性引物，经PCR克隆扩增获得了1个新基因 PGRP-A 的全长序列。该 序列全长961bp，包括由40个核苷酸组成的5’端非编码区 (5’UTR)、由582个 核苷酸组成的开放阅读框 (ORF)编码193个氨基酸，以及由339个核苷酸组成的3’ 端非编码区 (3’UTR)。其中，编码氨基酸的预测分子量大小为22.0kDa，等电点为 7.368。构建系统进化树分析表明柞蚕 PGPR-A 氨基酸序列与印度柞蚕 PGRP 的同 源性最高。 2.PGRP-A 基因的表达分析： 采用PCR方法扩增了柞蚕 PGRP-A 的 ORF，并连接至表达载体 pET-28a(+) ， Transetta DE3 IPTG 然后将重组质粒转入大肠杆菌 （ ）中，用不同浓度的 进行诱导 表达，经过 SDS和 Western blotting 检测，结果表明重组蛋白在大肠杆菌中 得到了稳定的表达，并用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，为下一步研究其 功能奠定了基础。 关键词：柞蚕，肽聚糖识别蛋白（PGRP），PGRP-A，基因克隆，表达分析，蛋白纯 化 I Abstract Abstract AAbbssttrraacctt Insect immunity is different from vertebrate immunity; they have no Tcell, B cell and complement system.Although they don’t have the adaptive immune system, they can resist rapidly and effectively to infection of various pathogens through innate immune system. Peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) can recognize peptidoglycan of microbial surface and play an important role in immune regulatory pathways. PGRPs have been found in many insects and other animals, although these PGRPs are conservative in the structure,theirfunctionandexpressionpatternsisdifferent. Antheraeapernyiis a kind of wild silk-producing insect, which blongs to Lepidoptera Saturniidae Antheraea.