核衣壳靶向灭活略筛选抗猪2型圆环病毒基因的初步研究.pdfVIP

摘 要 猪2型圆环病毒（porcine circovirus type 2, PCV2 ）是猪断奶后多系统衰竭综合征 （postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS ）的原发病原，并与猪皮炎肾病 综合征（PNDS ）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC ）、增生性坏死性肺炎(PNP)、新生仔 猪先天性震颤（CT-AII ）等的发生密切相关，这些疾病被统称为猪2型圆环病毒病。 猪2型圆环病毒病已成为严重危害养猪生产的重要的免疫抑制性疫病，给养猪业造成 了巨大的经济损失。 面对PCV2给养猪业造成的重大损失，目前市场上却没有相应的有效疫苗和药物。 因而探索抗猪2型圆环病毒感染的新策略成为当今研究的热点。衣壳蛋白靶向灭活 (capsid targeted viral inactivation ，CTVI)策略是近年来新兴的基于蛋白水平的抗病毒 策略，与其他基于核酸水平的抗病毒策略（如RNAi ，反义核酸，核酶等）相比具有 稳定、特异、高效、可有效避免因突变引起的免疫逃逸等优点。CTVI策略的出现为 抗猪2型圆环病毒感染提供了新的思路。 本研究主要探索了CTVI策略应用于抗猪2型圆环病毒感染的可行性，构建了衣壳 蛋白靶向核酸酶融合基因结构，并对基因结构的抗病毒效果进行了检测。 从金黄色葡萄球菌中直接扩增获得了金黄色葡萄球菌核酸酶的编码序列，通过拼 装获得了将该核酸酶置于PCV2核衣壳蛋白氨基端（JNPC ）和羧基端(PNJC) 的两种融 合蛋白基因。以pET-20b （+ ）原核表达载体为骨架对融合基因进行原核表达，并对表 达产物生物学活性进行了分析。结果表明构建的两个融合蛋白基因表达的蛋白分子量 大小约47KD ，与预期大小相一致。使用特异性抗体进行Western Blot分析显示蛋白产 物为融合目的蛋白。表达产物具有降解核酸的核酸酶活性，能够对DNA进行切割。 这些结果为进一步探讨猪2型圆环病毒衣壳蛋白靶向抗PCV2感染作用的研究奠定了 基础。 以pIRESneo载体为骨架构建了JNPC 、PNJC 、Cap基因真核表达载体，通过细胞 转染和G418筛选获得了稳定表达上述三个基因以及携带pIRESneo载体的细胞系。采 用PCR ，RT-PCR ，Northern Blot 、Western Blot 、DNA消化实验对转基因细胞系和蛋 白表达产物进行鉴定与检测。结果显示转基因细胞系中有外源基因整合，融合基因在 mRNA水平表达水平较低，经验证主要由融合基因存在异常拼接所致，细胞中有融合 蛋白表达，且融合蛋白产物具有良好的核酸酶活性。 上述四个转基因细胞系及未经转基因的细胞进行病毒传代实验，通过半定量PCR 和荧光定量PCR检测各细胞系中PCV2基因组含量，分析抗病毒效果。结果表明，病 毒传递10代后，两种检测方法中，JNPC转基因细胞系病毒滴度与对照组相比分别下 降了约60.55 ％和53.46 ％，而其他组间病毒滴度非常接近。两种方法结果基本相符， 说明了所得数据的准确性。这一结果证明了CTVI策略适用于PCV2 的抗病毒基因的筛 选，获得了具有一定抗病毒效果的基因结构JNPC 。但与已有的关于CTVI策略在其他 病毒中应用的研究结果相比还不够理想，抗病毒效率还比较低。 总之，本研究在细胞水平上证实了CTVI策略应用于抗猪2型圆环病毒感染的可行 性。研究获得了抗PCV2感染的基因结构，为抗PCV2基因筛选及相关转基因猪新品种 的培育奠定了基础。 关键词 衣壳蛋白靶向灭活；猪2 型圆环病毒；抗病毒；基因结构 A preliminary study on screening of the porcine circovirus type 2 resistant genes by capsid targeted vrial inactivation Master Candidate: DAI Hongxing supervisor: Prof. FAN Baoliang Major:Animal Genetics, Breeding and Reproduction