2013分子生物实验讲义.docVIP

分子生物学实验 课程 讲 义 总学时：32\16 周学时：2 适用年级专业：生物技术2011级\生物科学2010级 开课时间：2012－2013学年第 2学期 授课教师姓名：胡凯 目录 实验一 基因组DNA的提取 实验二 基因组DNA的纯化 实验三 DNA的琼脂糖电泳检测 实验四 DNA的琼脂糖回收 实验五 PCR基因的扩增 实验六 质粒DNA的提取 实验七 核酸的荧光定量检验 实验八 大肠杆菌的感受态细胞制备 实验九 大肠杆菌的质粒转化 实验一 基因组总DNA的提取 一、实验目的与原理简介： 抽提的DNA可用于PCR、Southern blotting、DNA文库构建等操作。 细胞中DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或染色体DNA， DNA约为109bp，如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。在DNA提取过程中，DNA分子的降解很难避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。DNA的提取常用的有以下两种方法： SDS（十二烷基硫酸钠）法：高浓度的SDS在较高温度下（55-65度）裂解细胞，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等，通过RNase A 消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。该法操作简便，能满足大多数实验需要。 CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐浓度（0.7mol/L NaCl）中是可溶的，通过离心就可将复合物同变性的蛋白质、多酚、多糖杂质（沉淀项）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质，直接向水相中加入预冷的异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，分离DNA沉淀并经75％乙醇漂洗后溶于TE （或纯水）得到DNA的粗提物。 用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应进一步纯化。用RNase水解RNA，用酚：氯仿：异戊醇和氯仿：异戊醇抽提去蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。 该法可以通过高盐缓冲液的选择型沉淀能很好的去除材料中的多酚及糖类杂质，得率高，质量好，用于PCR、Southern杂交、分子标记、DNA文库构建等。 二、实验准备： SDS提取液： 100 m M Tris-HCl (PH 8.0) 2.5%(V:V) 巯基乙醇 500 m M NaCl 20m M EDTA 1.5% SDS CTAB抽提液： 2%（w/v）CTAB 100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0) 20 mmol/L EDTA(pH8.0) 1.4 mol/L NaCl 醋酸钠： 3 mol/L NaAc 用冰乙酸调pH值至4.8-5.2。 TE溶液： 100mmol/L Tris-HCl 1.00 mmol/L EDTA 调pH值至8.0 。 为防止Dnase的降解作用，提取使用的各种器具及溶液均应经过高压灭菌。 三、实验步骤 CTAB 法DNA的粗提 1、加入250 mg土壤、730μl 提取缓冲液、70 μl裂解液和600mg 0.1mm 玻璃珠到2ml离心管中，70℃水浴10min。 2、加入使用Tissrelyser (10min 20Hz,2次或者10min 25Hz,1次)。 3、裂解管离心14000g×1分钟,转移上清(约600ul)到新管，加入300ul 腐植酸吸附剂和200ul 10M乙酸铵，室温放置5min，离心14000g×5分钟，将上清液转移到一个新的1.5ml离心管中。 【如样品中腐殖酸含量高，溶液颜色较深，可加入腐殖酸吸附剂再处理一次】 4、冷至室温后加入等体积(5ml)氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠倒混匀使乳化10min；10000转／分离心10min（18-20℃）； 吸取上清于另一干净的2ml离心管中；　　　　　　　 注：根据需要可用氯仿：异戊醇如上法重复抽提一次；吸取上清时一定不要打破沉淀层 吸取上清加入与上清液等体积（约4至5ml）且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现； 注：若没有沉淀出现，则加入上清液1/5至1/10体积的pH4.8-5.2的3M NaAc,混匀，于－20℃冰箱中沉淀30min； 10000转／分离心10min（18-20℃）；弃上清，用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇； 用1ml 75%乙醇再漂洗一次； 用无水乙醇再漂洗一次； 10.沉淀于室温或60℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明；用100μl TE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，得DNA粗提物，可用于PCR等。 实