实验操作技术规范编写要点.docVIP

细胞生物学实验操作规范 目录 一、显微操作技术： 3 二、细胞培养技术： 3 第一章 细胞培养基础 3 1.细胞培养基本概念： 3 2.细胞培养的环境 3 3.细胞培养设施和基本条件 4 无菌操作技术要领 5 4.培养用品的清洗与消毒 6 第二章 细胞培养液 11 第一节 水与平衡盐溶液 12 第二节 细胞培养基的基本要求 12 第三节 天然细胞培养基 13 第四节 干粉培养基的配制 18 第五节 无血清技术及其培养基 18 第六节 其他细胞培养用液 21 第三章 细胞培养的基本方法 23 第一节 培养细胞的细胞生物学 23 第二节 细胞分离技术 30 第三节 细胞的冻存与复苏 32 第四节 细胞计数及活力测定 35 第五节 培养物的污染及防止 36 三、制片技术： 40 1.载玻片和盖玻片的使用 40 2.切片技术（徒手切片）： 41 3.压片技术： 42 4.涂片技术： 42 5.滴片技术： 43 6.装片技术 44 四、染色技术 44 一、线粒体和液泡系的超活染色与观察 44 二、DNA-Feulgen染色 46 三、台盼蓝染色 47 四、DAPI染色 47 五、参考文献 47 一、显微操作技术： 二、细胞培养技术： 第一章 细胞培养基础 1.细胞培养基本概念： 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。 在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤成纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无限制制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。 细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。 1、无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。 2、恒定的温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。 3、气体环境 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。 二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。 细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变化的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。 4、细胞培养基 培养是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。 （1）合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。 （2）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促粘附因子及其多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。常见使用最为5-20%。 1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响