实验六蛋白质的定量分析-双缩脲法测定血清总蛋白要点.pptVIP

实验 双缩脲法测定蛋白质浓度 实验目的 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习蛋白质含量测定的常见方法及原理 3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法 一、分光光度法测定的原理和方法 一、分光光度法的基本原理 根据物质对光的选择性吸收（吸收光谱），对物质进行定性定量分析。 二、吸收光谱 主要分为： 红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.5-1000?m，主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200-400nm，可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400-750nm，主要用于有色物质的分析。 三、分光光度法的主要研究方式 1. 比较吸收光谱曲线 2. 比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm， 核酸的最大吸收波长为260nm。 3. 比较吸光度的比值 纯DNA 四、分光光度仪的工作原理 五、分光光度仪进行定量的原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=εCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； ε为摩尔消光系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 六、定量的常用方法 （1）标准曲线法 　　　　　　　　　　　　　　　　　 标准曲线与样品的测定条件必须一致。 （2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/?（?为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。 二、蛋白质含量测定的常见方法及原理 微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。消化后在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品、可回收利用、低浓度盐类不干扰测定。 缺点在于对测定哪些与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差；而样品中如果含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大干扰。 双缩脲法测定蛋白质* 蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此可以发生双缩脲反应： H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 ? H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3 在碱性溶液中，双缩脲能与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比。双缩脲法测定蛋白质范围1-10mg。 双缩脲法测定蛋白质* 双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同；重复性好，干扰少，常见干扰大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，适于手工和自动化分析。 缺点是灵敏度较低。但检出限为0.2—1.7mg蛋白质/ml，这相当于70g/L的血清3—24?L，已能满足临床生化检验的需要。因此，是临床测定血清总蛋白质首选的最方便、实用的常规方法。 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。 其不足之处是此反应受多种因素干扰（Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。 Folin-酚试剂包括甲、乙试剂。其中乙试剂仅在酸性PH下稳定，但上述还原反应只在pH10的情况下发生，故乙试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应能发生。 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因