实验六植物原生质体分离及融合要点.pptVIP

材料： 植物叶片（菠菜叶片） 用具： 倒置显微镜，离心机，过滤筛（100目），漏斗，烧杯，吸管，长注射针，注射器（5—10ml）等。 试剂： 1.纤维素酶2% ，果胶酶1% （在0.65M甘露醇，0.05M氯化钙和0.1%MES中，pH调至5.6—6.0） 2. 0.16M氯化钙溶液（内含0.1%MES）Ph5.6。 3. 22%蔗糖溶液 4. 30%聚乙二醇（PEG）溶液 5. 高pH高钙洗脱液（Ph=9） 0.1M氯化钙 0.1M梨酶醇 0.5ml/100ml 1M Tris 6. 0.24M 氯化钙 （一）原生质体的分离收集 1.取菠菜叶片撕去下表皮，称0.2g,切成小块放到10ml酶液中，在26℃下酶解4—5小时，或含酶量减半过夜，期间轻轻摇动几次。 2．用100目的过滤筛过滤。 3.用与滤液等体积的0.16M氯化钙溶液冲洗过滤筛，使冲洗液冲入过滤液。 4.滤液用离心机100—300rpm，离心5分钟，弃上清液。 5.沉淀中加入0.16M氯化钙溶液1—2ml于沉淀，轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离心管底部轻轻地加入6—8ml 22%蔗糖溶液，使之形成界面。 6.静置待原生质体形成一条带时弃去上、下液及残渣，用吸管收集原生质体。 7.用.0.24M 氯化钙溶液洗涤一次，离心吸取上清液。 8.沉淀中加入1—2ml.0.16M氯化钙溶液悬于沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密度为200000个/ml。 9.取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的纯度和完整性，也可用荧光显微镜检查。 （二）原生质体融合操作 1.取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置10分钟，使原生质体沉淀在载玻片上。 2.在两滴悬液之间加一滴30%聚乙二醇（PEG）溶液，使3滴溶液相连，室温下（15℃—20℃）。作用5—10分钟，在显微镜下观察原生质体粘连情况。 * 实验六 植物原生质体分离及融合 实验目的 了解植物原生质体分离、融合基本原理。 掌握植物原生质体分离、融合基本过程。 实验原理 植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为作物改良的有力工具之一。 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 原生质融合 外界因素作用下，两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细胞的过程称为植物细胞融合，或植物体细胞杂交。 原生质融合 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法： 我们本次试验主要用的是聚乙二醇法。 PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。 PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。 原生质融合 实验用品 纯化后的叶肉原生质体 原生质体融合 双荧光素标记 实验方法 原生质体融合的作用： (1) 可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲合性； (2) 可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变异范围极广； (3)一次操作可实现两个以上亲本的融合作用 (4) 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； (5) 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种； * 09级生物科学班