实验一线粒体和细胞核的制备与观察要点.pptVIP

* * 血细胞中的血红蛋白呈碱性，属嗜酸性成分，只能与酸性（阴离子）染料结合。 * * 细胞生物学实验 细胞生物学实验 实验一 线粒体和细胞核的制备与观察 细胞内线粒体的超活染色与观察 细胞生物学实验 实验目的 通过动物肝细胞核、线粒体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 掌握用差速离心法分离动物细胞核及线粒体的技术. 了解分级分离细胞核与线粒体的纯度检测方法 学习线粒体活性染色技术, 观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布 实验原理 制备线粒体及细胞核采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。 悬浮介质通常采用一定pH的缓冲蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。 线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶,该酶能使脂溶性的詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色. 线粒体能在詹纳斯绿B染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布； 詹纳斯绿B是一种是毒性较小的碱性染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色，其原理主要是碱性染料的胶粒表面带有阳离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。 细胞核DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的碱性染料以离子或氢键结合而被染色，此外，由于核蛋白中还有少量的弱酸性物质，因此，詹纳斯绿B也能被堆积下来而使细胞核呈现蓝色。 活体染色 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。 它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。 活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 活体染色 根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分为体内活染和体外活染两类。 体内活体染色：是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。 体外活体染色(超活染色)：它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 ?作为活体染色剂：对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总要配成稀淡的溶液来使用。 活体染料多为碱性染料,如中性红,詹纳斯绿B,次甲基蓝等 对某种细胞器的染色具有专一性,如中性红染液泡, Janus green B染线粒体。 实验用品 实验材料 小白鼠肝脏 人口腔粘膜上皮细胞 实验用品 实验试剂 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4) 0.2%和0.02%詹纳斯绿B(Janus green B)染液 生理盐水 仪器、用具：显微镜，高速冷冻离心机,玻璃匀浆器,解剖器具，剪刀，漏斗，尼龙网，刻度离心管等 实验内容 1.小鼠细胞器(细胞核,线粒体)的分离提取 2.分离提取物(细胞核,线粒体)鉴定 3.人口腔粘膜上皮细胞线粒体超活染色 1.细胞器(细胞核,线粒体)的分离提取 (1）获取肝脏：用颈椎脱臼法处死小鼠,置于解剖盘中剪开腹腔,迅速取出小鼠肝,称重1克放入小烧杯内用吸管吸取预冷的生理盐水洗净血液。 (2）匀浆：将鼠肝剪碎置于预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液中洗涤数次至鼠肝发白。然后置于玻璃匀浆器中，加入10ml预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液匀浆至肝组织基本碎裂(分次加入缓冲液)。（注：整过程在冰浴上进行） (3）过滤：双层尼龙布将匀浆液过滤到预冷的小烧杯中。 实验步骤 （4）细胞核与线粒体分离： 匀浆滤液 8mL，1000×g离心10min 沉淀1（细胞核及碎片）涂片A 上清液 1(涂片B,鉴定细胞核、线粒体) 重悬沉淀并洗涤1次 （8mL预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液，1000×g 离心10min） 沉淀2（细胞核及碎片） 涂片D 11000×g离心10 min 沉淀3（线粒体） 涂片E 上清液 3 涂片F 上清液 2 （涂片C） 注意：沉淀与上清液从离心机取出后均要置于冰浴上 取悬液1 滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的载片，放在悬液滴前面慢慢向另一端推动力移，保持推片与载片30 ～45°角，液滴即沿推片散开，注意用力平稳均匀，载片上便留下一层薄膜。 涂片示意图 2.分离提取物(细胞核,线粒体)鉴定 将共6张涂片，不待干即滴加0.2%Janus greenB染色15-20min后,盖上盖玻片，镜检 线粒体呈蓝绿色,圆形、椭圆或短棒状颗粒。如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色絮状，难以辨认。 细胞核呈深蓝色。 血细胞不着色。 注意：得到的沉淀物须加预冷0.25mol/L蔗糖缓冲液将其悬浮后再装片，制线粒体装片时