果梅PmKNAT2基因全长cDNA克隆及表达分析.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(17):3444-3452 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.012 果梅PmKNAT2 基因全长cDNA 克隆及表达分析 孙海龙，宋 娟，高志红，倪照君，章 镇 （南京农业大学园艺学院，南京210095 ） 摘要：【目的】从‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2，并对其结构特征及表达模式进行分析，为研究果梅雌蕊败 育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI 中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2 （KNAT2 的同源基因） 序列（EF093491 ），根据桃的KNOPE2 序列设计特异引物；采用改良CTAB 法提取 ‘大嵌蒂’果梅花芽总RNA；通过 RT-PCR 和RACE 技术获得基因cDNA 序列全长；使用DNAMAN 软件进行序列拼接；利用NCBI 数据库中的BLASTn 和 BLASTp 程序进行相似性分析；通过生物信息学方法分析结构特征；用DNAMAN 软件分析基因的ORF 和氨基酸序列； MEGA4.0 软件进行系统进化树的构建；利用 Bioxm2.6 推测分析蛋白分子量和等电点；根据 NCBI 中 Conserved Domains 程序进行蛋白质保守域结构预测；用 ExPaSy 提供的在线 SOPMA 程序进行蛋白质二级结构预测；构建 PJIT166-PmKNAT2-GFP 的融合亚细胞定位表达载体，采用基因枪法转化洋葱表皮细胞，经暗培养后在激光共聚焦 显微镜下观察；利用实时荧光定量RT-PCR 研究其表达模式，分析其在 ‘大嵌蒂’花芽发育不同时期、不同器官中的 表达特性。【结果】在 ‘大嵌蒂’果梅中获得一个KNAT2 的同源基因，命名为PmKNAT2，其cDNA 全长为1 402bp，5UTR 47 bp，3UTR 293 bp，编码区全长为1 062 bp，编码353 个氨基酸，预测蛋白质分子量为40.41 kD，理论等电点 为4.85。蛋白结构分析表明该基因编码的氨基酸具有2 个结构域，MEINOX 结构域（KNOX Ⅰ和KNOX Ⅱ2 个亚结构域） 和HD （homomeodomain ）结构域，属于KNOX 蛋白；相似性分析发现该基因与GenBank 中其它来源的KNOX 蛋白序列的 相似性为50%—100%；系统进化树分析显示果梅PmKNAT2 与桃KNOX 聚为一类，表明与其亲缘关系最近。二级结构预 测结果表明PmKNAT2 所编码蛋白由47.14%的α-螺旋（Alpha helix ）、3.43%的β-转角（Beta turn ）、3.14 的β-折 叠（Extended strand ）和46.29%的随机卷曲（Random coil ）组成。亚细胞定位结果显示该基因编码的蛋白定位于 细胞核和细胞膜中。实时荧光定量RT-PCR 分析表明，在 ‘大嵌蒂’果梅不同时期花芽中PmKNAT2 的表达量存在一定 差异，PmKNAT2 在11 月份的表达量最高，9 月、10 月和11 月的表达量差异不明显，但与12 月和1 月花芽中的表达 量差异明显；生长素在1 月份含量最高，9、10、11 月份差异不明显，其含量变化趋势与PmKNAT2 表达趋势相反。对 该基因表达量最高的11 月份的花芽进行实时荧光定量分析发现：PmKNAT2 在各种花芽中均有表达，在不完全花（雌 蕊褐色、雌蕊畸形和无雌蕊）中的表达量高于完全花（雌蕊正常）。进一步分析PmKNAT2 在完全花与不完全花的不同 花器官中的表达量，结果表明 PmKNAT2 在完全花与不完全花的各部位的表达量趋势相似均为：萼片雄蕊花瓣，在 完全花雌蕊中的表达量最低。【结论】推测PmKNAT2 在雌蕊发育阶段的异常表达可能与 ‘大嵌蒂’果梅雌蕊败育有关。 关键词：果梅；雌蕊败育；PmKNAT2；基因克隆；特征分析；表达模式 Isolation and Expression Analysis of PmKNAT2 Gene from Japanese Apricot