过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(8): 1458-1470 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.08.002 过量表达棉花GhSAP1 提高转基因烟草的耐盐性 丁林云，张 微，王晋成，田亮亮，李妮娜，郭 琪，杨淑明，何曼林，郭旺珍 （南京农业大学农学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室/教育部杂交棉创制工程研究中心，南京210095 ） 摘要：【目的】SAP （stress-associated protein ）是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其 对逆境胁迫应答的反应，为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR 验证获得棉花锌 指蛋白基因GhSAP1，将带有目的基因的载体质粒通过PEG 介导转化棉花叶肉原生质体细胞，瞬时表达分析其编码 蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR 技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。 通过农杆菌介导叶盘转化法，经组织培养获得转基因烟草进行异位表达，检测其与抗逆相关的生理指标，证明其 提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF 长度为543 bp，编码一条含180 个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97， 分子量 19.3 kD，具有典型的A20/AN1 锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组 织器官表达分析显示，GhSAP1 在根、茎、叶中的表达量高，而在开花后 5 d 的胚珠中表达量很低。GhSAP1 受盐 -1 胁迫诱导，高盐处理2 h 后表达量最高。利用含 100 μg·mL Kan 的培养基进行抗性筛选转基因后代，结合目标 基因的PCR 与RT-PCR 验证，获得转GhSAP1 的转基因烟草阳性株系10 个。目标基因GhSAP1 均能在烟草基因组 -1 中整合并异位过量表达。随机选择3 个转基因烟草株系，盐胁迫处理显示，发芽一周的种子在含200 mmol·L NaCl 培养基上胁迫 12 d，转基因植株幼苗平均成活率为81.7%，比非转基因对照植株增加近 3 倍，其平均根长为 3.05 cm，极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1 表达较高的L2 纯系进行成株期烟草盐胁迫处理 30 d，转基因烟草 后代的SOD 活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U·g-1 FW 和8.37 %，均显著高于非转基因对照；与未胁迫 处理相比，转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为 0.17 mg·g-1 FW，而非转基因对照降低了0.39 mg·g-1 FW；盐 -1 -1 胁迫处理后，转基因植株的MDA 含量增幅为 7.42 nmol·g FW，而非转基因对照增幅达20.85 nmol·g FW；在盐胁 + + + 迫下，转基因植株具有更强的K 根部运输到植株绿色组织能力，其地上部的K /Na 为 1.23，显著高于非转基因 对照。【结论】GhSAP1 在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用，过量表达GhSAP1 可显著提高转基因烟 草的耐盐能力。 关键词：棉花；GhSAP1；超表达；转基因烟草；盐胁迫 Overexpression of a Gossypium hirsutum Stress-Associated Protein Gene (GhSAP1) Improves Salt Stress Tolerance