酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞beta;-防御素-1（SBD-1）基因表达的影响.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(19):3910-3918 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.19.013 酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞 β-防御素-1（SBD-1） 基因表达的影响 金 鑫，张 曼，范燕茹，王 佩，杨银凤 （内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特 010018 ） 摘要：【目的】探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1（sheep beta-defensin-1, SBD-1） 表达的调节作用，为在分子水平上揭示益生菌对防御素的调控机理提供一定的理论基础及依据。【方法】首先将新 鲜的绵羊瘤胃组织用 PBS 和抗生素处理后进行瘤胃上皮细胞原代培养，当原代细胞数量长到细胞培养瓶的 85%以 上时，将细胞传于12孔板用于细胞刺激试验。同时将活化并纯化后的酿酒酵母菌25℃、180 r/min有氧培养48 h 后，进行5次平行平板计数试验，根据平板计数的数据处理方法，得到浓度为5.2×108 -1 CFU·mL 的酿酒酵母菌液， 再通过倍比稀释把所得菌液依次稀释成浓度为 5.2×107 6 5 4 -1 、5.2×10 、5.2×10 、5.2×10 CFU·mL 的菌液，用以上 不同浓度（5.2×104 8 -1 —5.2×10 CFU·mL ）的酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞分别进行不同时间（2、4、 8、12、24 h）的刺激，并设置对照组用DMEM/F12培养基代替酿酒酵母菌。然后提取总RNA，逆转录为cDNA后， 利用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测瘤胃上皮细胞中SBD-1表达差异。最后用SAS 9.2 软件对数据进行相关差异性分析。【结果】荧光定量 PCR 结果表明，在各时间组内 SBD-1 mRNA 的表达量随着菌液 浓度的增加均呈先升高后降低的趋势，当菌液浓度为5.2×107 -1 CFU·mL 时表达量达到最大，并与对照组和其他浓度 组相比差异极显著（P ＜0.01）。当菌液浓度一定时，SBD-1 mRNA的表达量先是随着刺激时间的延长而呈上升趋势， 刺激时间为12 h时SBD-1 mRNA表达量达到峰值，之后呈下降趋势。因此，当浓度为5.2×107 -1 CFU·mL 的菌液刺激 瘤胃上皮细胞 12 h 后，SBD-1 基因的表达量达到最高，且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著（P ＜ 0.01）。ELISA 检测结果显示，SBD-1蛋白表达趋势与SBD-1 mRNA检测结果基本一致。不同浓度的菌液分别刺激绵 羊瘤胃上皮细胞 2、4、8、12、24 h 后均能提高共培养上清中 SBD-1 蛋白的表达，且与对照组相比存在极显著差 异（ 7 -1 P ＜0.01）。在菌液浓度为 5.2×10 CFU·mL 刺激瘤胃上皮细胞 12 h 后 SBD-1 蛋白分泌水平达到最高，与此浓 度下各时间组相比差异极显著（P ＜0.01）。【结论】酿酒酵母菌能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达，且