受青枯菌诱导表达的马铃薯转录因子类StWRKY8的克隆与表达分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(21):4219-4226 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.21.003 受青枯菌诱导表达的马铃薯转录因子类 StWRKY8 的克隆与表达分析 薛 珍，李 卉，孔超越，段婷婷，郜 刚 （山西师范大学生命科学学院，山西临汾 041004 ） 摘要： 【目的】从接种青枯菌（ Ralstonia solanacearum ）的马铃薯中薯 3 号（Solanum tuberosum ）中克 隆类 StWRKY8 部分序列，分析其序列结构特征，研究该基因在感、抗病基因型马铃薯中受诱导的差异表达模式及 其不同的组织表达定位。【方法】分别培养抗病基因型马铃薯ED13、感病基因型中薯3号至9—10叶期，以伤根 浸菌法接种青枯菌菌株 PO41。提取叶片总 RNA，反转录为 cDNA，使用 PCR 筛选 cDNA 差减试剂盒构建消减文库， 筛选出384个阳性克隆作为原始SMART cDNA文库，采用5-RACE法根据 SMART-RACE cDNA扩增试剂盒说明克隆全 长类 StWRKY8。并分别应用生物信息学软件BioEdit、BLAST、MEGA 5.0分析类 StWRKY8 的基因序列、序列相似性 比对以及建立系统进化树。利用ProtParam、ProtScale、SWISS-MODEL、NetPhos2.0 Server、WOLF PSORT、TargetP1.1 Server等在线服务器预测类StWRKY8的理化特性、三级结构、磷酸化位点以及亚细胞定位。提取马铃薯ED13、中 薯3号接种青枯菌后的叶片总RNA，采样时间点分别为处理后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d和6 d，运用反转 录PCR和荧光定量PCR检测类 StWRKY8 的表达情况。以类 StWRKY 特异 PCR产物制备地高辛标记探针，取材料茎、 叶组织制作石蜡切片，并与标记探针进行原位杂交，定位其组织表达。【结果】获得了类 StWRKY8 cDNA部分序列， 长563 bp，包括一个完整开放阅读框258 bp，编码85个氨基酸。类StWRKY8属于第二类 WRKY，锌指结构类型为 C H ，具有一个典型的 WRKY 保守结构域。其氨基酸序列与茄科（Solanaceae ）其他成员具有高度同源性，与马铃 2 2 薯转录因子 StWRKY8 相似性高达98%。预测类StWRKY8等电点约为9.1，半衰期大于5.5 h，为水溶性蛋白，其三 维结构为非球状分子，含有 3 个磷酸化位点，亚细胞定位于细胞内。类 StWRKY8 受青枯菌诱导后表达上调，且在 感、抗病基因型马铃薯中表达有差异。类 StWRKY8 在感病基因型马铃薯接种青枯菌 6 h 内表达量较低，而在抗病 基因型马铃薯接种青枯菌6 h内高强度表达。该基因主要在茎叶维管束系统的韧皮部表达，具有组织特异性。 【结 论】类 StWRKY8 具有转录因子的一般结构特征，受青枯菌等病菌的诱导表达，同时受寄主植物固有抗性的影响， 在感、抗病基因型中表达模式不同。推测其在植物防御反应中发挥作用并参与机体调控。 关键词：马铃薯；青枯菌；转录因子；类 StWRKY8；基因表达；组织定位 Cloning and Expression Analysis of the Potato Transcription Factor StWRKY8 Like Gene Induced by Ralstonia solanacearum XUE Zhen, LI Hui, KONG Chao-yue, DUAN Ting-ting, GAO Gang (College of Life Science, Shanxi Normal University, Li