通过缺失大丽轮枝菌Vdku80构建其高效基因敲除受体菌株.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(11):2142-2150 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.008 通过缺失大丽轮枝菌Vdku80 构建其高效基因敲除受体菌株 1 1 2 1 1 田 李 ，刘 娜 ，徐荣旗 ，曲志才 ，刘 乾 1 2 （曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜273165 ； 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081） 摘要：【目的】验证大丽轮枝菌（Verticillium dahliae ）非同源末端连接途径关键基因Vdku80 的功能，构 建高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。【方法】利用常规基因敲除的方法，构建大丽轮枝菌 Vdku80 基因缺失的 突变体菌株ΔVdku80。即将Vdku80 的同源重组DNA 片段（Vdku80 的基因组上下游DNA 片段之间连接潮霉素抗性基 因）通过农杆菌介导的转化转入大丽轮枝菌，通过同源区段的重组，潮霉素抗性基因便会替换掉野生型Vdku80， 从而获得突变体菌株ΔVdku80。对突变体菌株ΔVdku80 的生物学表型，即生长速率、产孢量和对棉花的致病性进 行测试。分别以大丽轮枝菌野生型菌株和ΔVdku80 作为受体菌株，采用上述基因敲除方法测试2 个几丁质合成酶 编码基因ChsV 和ChsVI 的基因敲除效率。【结果】成功构建了Vdku80 缺失突变体ΔVdku80。野生型和突变体菌株 ΔVdku80 在PDA 培养基上的菌落形态相似，且培养8 d 后菌落直径无明显差别。野生型和突变体菌株ΔVdku80 产 孢高峰均出现在摇瓶培养后第 5 天，且该时期产孢量亦无明显的变化。浓度为 0.02%的MMS 对野生型和突变体菌 株ΔVdku80 的生长均有明显的抑制作用，且抑制程度相同。接种野生型和突变体菌株ΔVdku80 4 周后，棉株真叶 均开始表现出萎蔫、褪绿等发病症状，野生型和突变体菌株ΔVdku80 对棉花造成的病情指数分别为54.2 ±4.9 和 53.6 ±5.4，亦无明显变化。因此，突变体菌株ΔVdku80 的生长速率、产孢量和致病性相对于野生型菌株均未发生 明显变化。使用野生型菌株作为基因敲除的受体菌株，几丁质合成酶编码基因ChsV 和ChsVI 的基因敲除转化子在 总转化子中的比例分别为44%和31%；而使用ΔVdku80 作为基因敲除的受体菌株，几丁质合成酶编码基因ChsV 和 ChsVI 基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为94%和87%。【结论】Vdku80 缺失的菌株ΔVdku80 作为受体菌株 可以提高其他基因的基因敲除效率，且Vdku80 的缺失对大丽轮枝菌的生长速率、产孢量和致病性均无影响，因此 不会干扰其他基因的敲除所带来的表型变化。Vdku80 缺失的菌株ΔVdku80 可作为高效的大丽轮枝菌基因敲除受体 菌株。 关键词：大丽轮枝菌；基因敲除效率；同源重组；非同源末端连接 Construction of Enhanced Gene Knockout Frequency Recipient Strain by Deletion of Vdku80 in Verticillium dahliae 1 1 2 1 1 TIAN Li , LIU Na , XU Rong-qi , QU Zhi-cai , LIU Qian 1 2 ( College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu 273