细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备.pdfVIP

中国农业科学 2012,45(12):2491-2501 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.12.019 细粒棘球绦虫Hsp70 基因的克隆、表达及抗体制备 1,2 3 1 2 1 1 1 1 赵 莉 ，陈皓斐 ，张文宝 ，马正海 ，张壮志 ，张 旭 ，古努尔·吐尔逊 ，米晓云 ， 1 1 1 金映红 ，薛 晶 ，石保新 1 2 （新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐 830000； 新疆大学生命科学与技术学院/新疆生物资源基因工程国家重点实验室，乌鲁木齐 830046； 3 新疆疾病预防控制中心免疫规划科，乌鲁木齐 830002 ） 摘要：【目的】克隆细粒棘球绦虫( Echinococcus granulosus , E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70，在原核细 胞中表达、纯化Hsp70 蛋白并制备其特异性抗体。【方法】 从包囊中分离原头蚴，提取RNA，RT-PCR 扩增EgHsp70 基因的cDNA，将其构建至原核表达载体pMAL-p2x，转化大肠杆菌BL-21 菌株。通过改变诱导温度、IPTG 浓度和 诱导时间筛选出EgHsp70 融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下 多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清，ELISA 和Western blotting 检测血清效价和特异性。【结果】 RT-PCR 扩增 获得EgHsp70 基因的cDNA，酶切和测序结果表明EgHsp70 基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出 Hsp70 融合蛋白可溶性表达的最佳条件为：当A 为0.6 时，以0.3 mmol·L-1 IPTG 于30℃条件下诱导表达4 h。 600 SDS显示Hsp70 融合蛋白相对分子质量约为68.6kD，经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70 融合蛋白，其表 -1 达量为 2.5 mg·L 。Western blotting 检测证明制备的抗血清与 EgHsp70 融合蛋白、原头蚴粗提抗原、 E.granulosis 虫体蛋白和E.granulosis 虫体表面蛋白均能特异性结合，ELISA 检测表明获得的抗血清效价达到 1 ﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70 融合蛋白，并制备了高效价的兔抗EgHsp70 蛋白抗 血清，为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。 关键词：细粒棘球绦虫；热休克蛋白家族基因Hsp70；抗血清 Cloning, Prokaryotic Expression of Echinococcus granulosus Heat Shock Protein 70 and Preparation of It’s Antiserum 1,2 3 1 2 1 1 ZHAO Li , CHEN Hao-fei ，ZHANG Wen-bao ，