小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测方法的初步建立.pdfVIP

中国农业科学 2006,39(4):819-824 Scientia Agricultura Sinica 小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测方法的初步建立 1，2 2 2 1，2 2 1 张永强 ，吴晓东 ，刘雨田 ，张海涛 ，王志亮 ，鲍恩东 1 2 （南京农业大学动物医学院，南京 210095 ； 农业部动物检疫所／国家外来动物疾病诊断中心，青岛 266032 ） c 摘要：【目的】通过表达羊PrP核心片段、单抗制备，最后建立免疫组织化学检测羊痒病方法。【方法】用PCR 方法从小尾寒羊基因组DNA 中扩增编码PrPc 核心片段DNA， 并克隆到硫氧还原蛋白融合表达载体pET-32a （+）上， 转化至 c c E.coli BL21，IPTG诱导融合表达。以纯化的重组小尾寒羊PrP 核心片段免疫PrP 基因敲除小鼠，利用淋 巴细胞杂交瘤技术，制备羊核心片段单克隆抗体。【结果】通过上述方法，得到相对分子质量约为35 kD的重组小 尾寒羊PrPc c 核心片段，筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrP 核心片段特异单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化试 验表明,其中4 株可特异性识别羊痒病脑组织切片中耐PK 酶消化的PrPsc ，经5次重复试验表明：所制备单抗与对 照单抗F89结果完全一致。【结论】利用原核表达，单抗制备等技术制备出PrP特异性单克隆抗体，用笔者自己研 制的单抗作为核心试剂初步建立了羊痒病免疫组化检测方法。 关键词：小尾寒羊；痒病；单抗；免疫组化 Establishment of the Method of Immunohistochemistry Assay for the Detection of Scrapie by Monoclonal Antibody 1,2 2 2 1,2 2 1 ZHANG Yong-qiang , WU Xiao-dong , LIU Yu-tian , ZHANG Hai-tao , WANG Zhi-liang , BAO En-dong 1 2 ( College of Veterinary Medicine ，Nanjing Agricultural University ，Nanjing 210095 ；National Diagnostic Center for Exotic Animal Disease / National Animal Quarantine Institute of Ministry of Agriculture, Qingdao 266032 ） Abstract: 【Objective 】The method of immunohistochemistry assay for the detection of Scrapie by monoclonal antibody was established. 【Method 】Genomic DNA was isolated from the ovine whole blood. Using the polymerase chain reaction to amplify t