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四环素诱导猪m4r基因表达载体的构建及体外表达研究
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目 录
中文摘要…………………………。……………………………………………………………I
英文摘要………………………………………………………………………………………．III
l引言…………………………………………………………………………………………………．1
1．1MC4R基因的概述………………………………………………………………………一1
1．1．1黑素皮质素受体的研究进展…………………………………………………………1
1．1．2
MC4R基因的研究概况………………………………………………………………2
1．2中枢黑素皮质素系统(CMS的研究进展……………………………………………．．4
1．2．1神经肽Y……………………………………………………………………………一4
1．2．2阿黑皮质素原………………………………………………………………………………．．4
1．2．3瘦素…………………………………………………………………………………．5
1．2．4刺鼠相关蛋白…………………………………………………………………………．．5
1．3四环素诱导的基因表达系统……………………………………………………………．．6
1．3．1四环素诱导表达系统的原理…………………………………………………………6
1．3．2
Tet．Off调控系统……………………………………………………………………．．7
1．3．3let．On调控系统………………………………………………………………………7
1．4实验目的与意义…………………………………………………………………………．8
2材科与方法……………………………………………………………………………………9
2．1实验材料…………………………………………………………………………………9
2．1．1实验用的载体…………………………………………………………………………9
2．1．2细胞和菌株…………………………………………………………………………．．9
2．1．3主要仪器设备…………………………………………………………………………9
2．1．4主要药品、试剂………………………………………………………………………9
2．1．5主要分子生物学软件………………………………………………………………10
2．2实验方法………………………………………………………………………………．．10
2．2．2重组质粒P1细胞转染及诱导表达水平的检测……………………………………13
2．2．4重组质粒P2细胞转染及诱导表达水平的检测……………………………………20
2．2．5诱导表达MC4R基因对成纤维细胞CMS系统关键因子的影响…………………．2l
3结果与分析…………………………………………………………………………………．．22
3．1P1载体的构建……………………………………………………………………………22
3．1．1民猪的MC4R基因的克隆……………………………………………………………………………22
3．1．2诱导表达载体P1的鉴定…………………………………………………………．．24
东北农业大学农学硕士学位论文
3．2重组质粒P1诱导表达水平结果………………………………………………………．．25
3．2．1成纤维细胞的培养及转染效果……………………………………………………．25
3．2．2MC4R基因诱导表达效果检测………………………………………………………26
3．3P2载体的构建…………………………………………………………………………一27
3．3．1启动子调控区扩增结果……………………………………………………………．27
3．3．2转录元件rTetR片段扩增结果……………………………………………………一29
3．3．3
P2载体的酶切鉴定…………………………………………………………………30
3．3．4
MC4R基因诱导表达效果检测………………………………………………………31
3．3．5诱导表达MC4R基因时CMS系统关键因子的相
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