柑桔裂皮类病毒速检测技术的研究及湖北分离物的克隆.pdf

中文摘要 类病毒是迄今为止己知的引起植物病害的最小致病因子，为单链环状RNA，不 编码任何蛋白质，易于形成一种由短双链区和单链环间隔组成的紧凑棍棒状二级结 构。植物类病毒能侵染多种高等植物并导致病害，其中柑桔是受类病毒危害较严重 的植物之一，目前已在柑桔类植物上发现7种类病毒，其中以柑桔裂皮类病毒的危 起以枳、积橙等为砧木的柑桔砧本部分外皮纵向开裂、翘起．呈鳞片状剥落．同时 树冠表现矮化，新梢少而弱，叶片变小、变弯曲，能导致柑桔产量明显下降，严重 影响着柑桔业的发展。 本研究采用聚丙烯酰胺双向凝胶电泳、反转录-PCR和核酸杂交三种方法对柑桔 裂皮类病毒进行了快速检测方法的研究，并成功地分离到了柑桔裂皮类病毒的湖北 分离物，对其进行了鉴定和序列分析，具体研究结果如下： 1．柑桔裂皮类病毒快速检测技术体系的建立 聚丙烯酰胺双向凝胶电泳法检测：将从阳性材料上提取的类病毒核酸，先在6％ 的聚丙烯酰胺非变性胶上进行第一向电泳，然后切割含类病毒分子的胶条，在变性 条件下进行垂直或反向电泳，最后银染观察。试验发现，阳性样品在落后于寄主植 物核酸带的位置均可见一条类病毒分子带，而阴性对照则没有这条带。该方法具有 快速简便、经济实用的特点。 反转录-PCR检测：参考已报道的CEVd核苷酸序列合成引物，分别对中柑所和 意大剩阳性样品进行RT-PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，发现在370bp左右 的位置上有特异性扩增条带，而且可以应用于待检样品的检测。该检测方法特异性 强、敏感性高，检测结果稳定、可靠，尤其适合于田阚样品的大规模检测， 核酸杂交法检测：利用已经克隆的美国柑桔裂皮类病毒eDNA序列，制各生物 素标记的核萤酸探针，采用斑点杂交的方法和组织印迹的方法分剐对阻性材料进行 杂交检测，通过胶片曝光显示杂交信号，发现在两种方法的检测结果中阳性材料都 有强的反应，而阴性材料无反应或较弱，该方法安全可靠、快速准确，适合大量样 品的检测。 2．柑桔裂皮类病毒湖北株系的分离鉴定与测序 从湖北省秭归县采集罗伯逊脐橙枝条，采用聚丙烯酰胺双向凝胶电泳、RT．PCR 并对其进行克隆、测序。这是我国首次进行CEVd完整核苷酸序列的测定，GenBauk 株系作序列系统进化树分析，发现其与从美国分离的三个株系具有很高的亲源性。 关键词：柑桔裂皮类病毒；聚丙烯酰胺凝胶电泳；RT-PCR『；核酸杂交；CEVd-HB 分离物：核苷酸序列 ‘ Abstract arethesmallestknown of Viroids pathogens consistofcircularand plants．They RNA．Inmost rod—like conformations．In single·stranded cases，theyadopt compact not for canbe contrastto do code lotof infected virus，viroids any protein．Aplants by in viroids citrus foundcitrus canbe causingdiseases，especiallyplants．Viroids plants classifiedintosevencitrusviroidsandcitrusexocortis themostserious viroid(CEVd)