柞蚕肠道菌群分及产酶菌的筛选与鉴定.pdf

摘 要 柞蚕Antherea pernyi 属于鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属， 是一种经济价值很高的生 物模式昆虫。分布于我国的 10多个省区，以山东、辽宁、河南等华北地区为主。 昆虫肠道微生物对宿主的营养、免疫具有重要作用，已有很多关于不同种类昆虫 肠道菌的研究。尽管家蚕（Bombyx  mori）肠道微生物群落结构得到了较多的研 究，但目前对柞蚕等野蚕肠道微生物的研究还很少。 由于不同肠道环境的差异，不同昆虫肠道微生物也有不同的生理差异，这种 差异也提供了更多待开发的微生物资源。 通过对柞蚕肠道菌群结构及产酶菌的研 究，了解野生柞蚕的肠道环境，探寻具有新的生理及功能的微生物，可用于研制 微生态制剂，提高柞蚕生产的叶丝转化率及抗病能力。 试验采用 NA、LB、萨氏培养基培养分离 5龄期柞蚕幼虫的肠道细菌，最终 得到 12株形态、生理生化表型各异的纯化菌株，结合 16S rDNA系统发育分析， 对其进行鉴定。经鉴定获得的柞蚕肠道菌有芽孢杆菌、葡萄球菌、肠杆菌属，其 菌群结构特征与家蚕存在相似性，其中以芽孢杆菌为主要菌群。采用筛选培养基 筛选产纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶的菌株，并测定产酶菌抑菌圈的 D/d 值和酶活 性，比较各菌株的产酶能力和酶活力。芽孢杆菌是分离得到的肠道菌中产纤维素 酶、蛋白酶的主要菌群，其产纤维素酶 D/d 值在 1.5左右，活性均在 100U/ml 以 上；产蛋白酶 D/d 值在 5.0 左右，活性大部分在 24U/ml 以上；葡萄球菌产蛋白 酶能力较弱，酶活力在 10U/ml 左右；肠杆菌不产酶；筛选得到的脂肪酶活性很 低。 由于蚕肠道上皮细胞不能合成纤维素酶， 肠道中能利用纤维素的细菌对蚕饲 料中纤维素的消化利用可能起重要作用。另外，纤维素酶在饲料、环境等工业中 有重要的实际应用意义。 试验纯化获得一株产纤维素酶活性较高的芽孢杆菌菌株  Bacillus subtilis，pH 7.0、50℃条件下，其胞外酶活可达 118.5U/ml。依据已解析 的细 菌 纤 维 素 酶 基 因 ，设 计 特 异 引物 扩 增 了该 菌 株 的 内切 葡 聚糖 酶 （endo­β­glucannase）基因，获得其 ORF 全长 1.5kb，编码 499 个氨基酸，蛋白 分子量约为 55Kd。将获得的酶基因连接至 pET­28a(+)  表达载体，转入大肠杆菌  BL21(DE3)  菌株中，用  IPTG  进行诱导表达，经  SDS­PAGE  电泳和  Western  blotting  检测，表明被诱导的目的蛋白得到了稳定的表达。与原菌株表达酶活性 相比，原核表达经传代培养到第三代有最高酶活性 126.8U/ml，可以达到原菌株 的活力水平，为以后的真核表达及微生态制剂的研究奠定基础。 关键词：柞蚕，肠道菌，产酶菌，纤维素酶，原核表达 I  Abstract  Antherea pernyi,  belonged  to  Lepidoptera,Saturniidae,is  a kind  of biological  model insect with high economic value.It distributes in more than 10 provinces and  areas in China,mainly in Shandong, Liaoning, Henan and other north areas of China.  It has been confirmed that intestinal microflora play an important role on nutrition,  immunization of host insect and so on.There are a lot of studies on intestinal bacteria  of different insects. Reling on combination of molecular technique and pure culture  method, microbial diversity ofgut of silkworm has also been a lot of