紫花苜蓿MsIPI基因克隆及对烟草遗传转化.pdf

摘 要 紫花苜蓿重要次生代谢产物皂苷属萜类化合物，异戊烯基焦磷酸异构酶 (isopentenyl diphosphate isomerase,简称IPI)是植物体萜类化合物合成途径中的 一个关键酶，其作用是将直接用于萜类合成的两个基本物质IPP 和他的异构物DMAPP 在一定条件下进行相互转化。紫花苜蓿是优良的豆科牧草，目前在我国及世界各地都 有大量栽培利用，其中所含皂苷具有重要的生物活性和药理作用。通过对异戊烯基焦 磷酸异构酶基因的研究，对于提高和控制其在植物体内的生化活性具有重要意义。 对已公布的异戊烯基焦磷酸异构酶EST 序列进行搜索和比对，选取了与紫花苜蓿 亲缘关系最近的蒺藜苜蓿的IPI 基因EST 序列为基准设计引物，利用RT-PCR 技术， 扩增获得MsIPI 基因cDNA 全序列。该基因开放阅读框全长870bp，编码290 个氨基 酸残基。利用DNAMAN 对该基因的氨基酸序列进行了生物性息学分析，经同源比对和 进化树分析，MsIPI 基因的氨基酸序列与蒺藜苜蓿、烟草、拟南芥、水稻、高粱的异 戊烯基焦磷酸异构酶氨基酸序列一致性达到90℅以上。 植物的表达载体构建，是将获得的EST 序列插入到植物表达载体pBI121 上，构 建了超表达MsIPI 基因的表达载体pBI-IPI，再通过农杆菌介导法转化农杆菌，利用 叶盘法转化烟草，以期得到MsIPI 基因超量表达的烟草转基因植株。对再生植株进行 抗生素筛选和PCR、RT-PCR 检测，结果6 株呈现阳性，证实目的基因已经整合到烟草 基因组中，已获得了转基因植株。通过GUS 基因组织化学染色检测，初步证实该基因 可以顺利转录。 关键词：紫花苜蓿；异戊烯基焦磷酸异构酶；基因克隆；载体构建；烟草转化 Cloning of MsIPI Gene from Alfalfa (Medicago sativa L.) and Transformation of Tobaccos Abstract Saponins from Medicago species are pentacyclic triterpenes, and they are of the most important secondary metabolites of Medicago sativa l L.. Isopentenyl diphosphate isomerase (IPI) is a key enzyme working in the biosynthesis progress of terpenoids in plants, and it plays an important role in introconverting IPP and its isomer DMAPP into each other under certain conditions. Medicago satival. L is an eximious leguminous forage which has been planted widely in China and all over the world . Saponins from M. satival L. take special pharmacological effects for their particular biological activities. MsIPI is a key gene controlling biosynthesis of saponins in Medicago species. Research on this gene is of great importance in controlling and improving biochemical activities of saponins in plants. By searching and comparing the publicated Isopentenyl pyrophosphate isomerase EST sequences, EST sequences of the I