球孢白僵菌原生体遗传转化研究及其杀虫相关基因的分离.pdfVIP

吉林农业大学颈 学位论二盘 玉米螟虫生真菌球雅臼僵茸原生厩体遗传转化体系研究及其乖虫相关基田的分离 中文摘要 遗传转化技术不仅是基础研究的重要手段，而且是利用基因工程改良物种特 性的有力工具。目前有关球孢白僵菌遗传转化体系的研究较少。本文针对分离自 吉林公主岭当地患病玉米螟虫体的野生型球孢白僵菌为研究对象，从产孢培养基 筛选、遗传转化显性标记筛选、原生质体制备、原生质体遗传转化等方面对球孢 白僵菌的遗传转化体系进行探索，为利用基因工程改良球孢白僵菌奠定了坚实基 础。研究结果表明： 1 菌丝生产最适培养基为L-broth液体培养基： 2 产孢 最适培养基为PDA培养基； 3 菌龄24h的菌丝体生产的原生质体产量最高，是 原生质体纯度达到99％以上，原生质体产量和再生恢复率较高； 5 真菌溶壁酶 质体制备的最佳渗透压稳定剂； 7 0．7mol／L葡萄糖为原生质体再生恢复的最 最高，最高可达到57％； 9 球孢白僵菌原生质体萌发可以被25m叠／L除草剂完 全抑制，孢子和菌丝体萌发可以被150m∥L除草剂完全抑制，草丁膦类除草剂 抗性基因bar可以作为选择标记基因； 10 通过原生质体遗传转化方法，将含 有bar基因的质粒PTFl02转化到球孢白僵菌，通过连续5代继代筛选，获得PcR 鉴定阳性菌落。 穿透体壁是球孢白僵菌感染寄主过程中的重要步骤之一。昆虫体壁主要由蛋 白质和几丁质组成，球孢白僵菌主要通过机械压力和蛋白酶、几丁质酶等水解酶 的作用降解昆虫体壁，因此，克隆编码这些酶的基因对阐明球孢白僵菌的致病分 子机理具有重要意义。本文根据己报道的病原真菌几丁质酶、体壁蛋白水解酶、 亲环素蛋白基因合成保守引物，从玉米螟虫生真菌球孢白僵菌中分别分离到几丁 质酶基因、体壁蛋白水解酶和亲环素蛋白基因，生物信息学分析显示： 1 几丁 质酶基因片段大小为1047bp，编码了348个氨基酸，与来源于小菜蛾虫生真菌 球孢白僵菌和哈茨木霉的几丁质酶蛋白序列同源性分别为99％和82％： 2 体 壁蛋白水解酶基因片段长度为1760bp，包含有3个内含子区段，分别位于331～ 1，』¨K70804 的蛋白，与蛋白数据库中同源蛋白 AAL5578 1 的最高同源性 分别为98．9％和98．7％； 3 亲环素蛋白基因片段长度为606b口，包含有2个内 个氨基酸组成的蛋白，与蛋白数据库中同源蛋自 AAN39296 的最高同源性分 别为99．4％。 关键词：球孢白僵菌；原生质体遗传转化；bar基因；基因克隆 吉林农业^学硕士学应诧文 玉米螟虫生真茁球孢自僵蓊琢生质休遗传转忧体系研究及其杀虫相关基因的分离 ABSTRACT rolenot lnbaslcresearchof Genetictransfonnationhasbeen an only playingimportant in butalsoin modificaiton nlany HoweV％ anolnopathogenesisinvesdgat工0ll genehc oI_ganlsms 订ansf曲madonfbr＆拧!n硭订d6甜s如n玎isfhfbm In s slem belr瞎perfectth醛rcpon，optimal medlum fbr and marker scrcenillggroⅢh gporeproduction，selectiongellescrceln＆protoplast lransf砷uationwerc Rcsults preparatlonconditions，PEG-lnediated invest培a【ed protoplasl rcvcaJed fastintheL_broth that 1 Themvceliumsof占6娜s姗d删n medium 2 11Ie medi砌forB．bassiana was straillfor produc矗onPDA 3 Theoptimal age 叩timal spores was24hours 1010 protoplastproduction culture，2．25xcclls／gmycelium， 4 Theopdmal conceII仃an彻of was00lmol几for and p-mercapIoethanoJ pmtoplastproductlon 99％ best was ce¨wall a11dthe degradatl0Il 0p缸mal regener撕伽 5 T11cen巧mesfungus en巧me were6O andl 5 osmoticstabilizer bme c彻centraⅡon，廿eatm