PCR、引物设计及逆转录PCR要点.pptVIP

4、G+C含量一般为40%-60% 引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。 G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于从模板上解离。 G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。 引物设计的基本原则 5、Tm值之差应小于1℃，最适退火温度在55-60℃。 一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR扩增效率下降或失败。 对于20bp左右的引物： Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C） 一般情况下，PCR的最佳退火温度比引物Tm值低5℃左右。 引物设计的基本原则 6、引物中四种碱基最好是随机分布的 避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否则会使引物在G+C富集序列区域产生错配，降低扩增的特异性。 引物设计的基本原则 7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身互补——发夹结构 引物之间互补——二聚体 引物自身连续互补碱基不应超过3个，引物之间连续互补碱基不应超过4个，尤其避免3’端的互补重叠。 引物设计的基本原则 8、引物的5’端可以修饰，3’端不可以修饰。 引物的5’端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生物素、引入点突变等。 由于延伸是从3’端开始的，所以不能