人白细胞介素1基因的克隆与表达.pdf

中文摘要 白细胞介素18(inter】eukin—l 8，1L一】8)是一种新发现的具有多种活性的细胞因子，在结构 上与】L．1相似，在功能上与JL一12相似，其昂具特征的活性是诱导Y一干扰素(1FN叫)的产生， 促进T细胞和自然杀伤(NK)细胞的增殖，同时增强NK细胞的杀伤力，并具有抗肿瘤和抗微 生物感染等多种疾病的作用，这些特性预示lL．18可做为一种治疗因子，因此对该因子的克隆与 表达在实际应用于临床之前有重要的意义。本研究应用现代分子生物学的研究手段和方法研究了 如下内容： 1．人白细胞介素18基因的克隆及序列分析从正常人肝脏组织中提取RNA，然后反转录成 cDNA，应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PcR)技术，自行设计并合成一对特异性引物，成功地 扩增出hIL-18 cDNA基因，并定向插入pGEM-T载体中，然后经PcR鉴定及限制性内切酶双酶 切鉴定，鉴定正确的质粒进行序列测定，用DNAstar软件将所测得的序列与原预期基因序列比 较，核苷酸序列基本一致，表明所构建的人白细胞介素18基因序列是正确的。 2．人白细胞介素18基因在大肠杆菌中的表达及其多克隆抗体的制备在获得人白细胞介 阳性重组质粒转化表达受体菌BL2，(陇3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达，进行表达产物的聚 丙烯酰胺凝胶电泳(sDs—PAGE)检测。结果表明，表达的蛋白带位于约20KDa处，hlL．18基 因获得高效表达。表达的蛋白经透析袋电洗脱法纯化后，对獭兔进行常规免疫，应用ELISA检 测到较高的多克隆抗体效价(】：25600)，表明此蛋白具有良好的免疫原性。Wes乜m．blot结果显 示，利用纯化包涵体制各的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合。 细胞介素18基因片段，克隆至p0EM-T载体，鉴定和测序正确的人白细胞介索18基因亚克隆 I和勋f 入带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pEcFP-c1的多克隆位点Ec0RI之间，成功构建融 合有报告基因的人白细胞介素18基因真核重组表达载体DEcFP。cl_hIL一18。 本研究获得了人白细胞介素18基因、原核表达载体以及融合有报告基因pECFP-C1的真核 表达载体，并且获得了该基因在大肠杆菌中的高效表达。为ILl8生物学特性及其应用奠定了基 础。 关键词：人白细胞介素18；自细胞介素18结合蛋白：克隆；原核表达：细胞因子 Abstl翟ct a has functions．1L—18 Interleukjn一18(1L-18)wascytokine，idem访edrecenfly，jtm锄ybi0109ical js tolL一1andsh引℃s withIL—12．IL-18 stnlctu删Jyhomologous biolo舀cal plays柚 pmperties rolein the and the ofT锄dNK importaIltinducingproducⅡonofIFN—Ypmmotingmultiplication cells， boostNK 8also an roleinhostdefence simulta工1eityup cells’execution，IL—l playsimponant against tumorand is in infection．So，it future．Thesecharacte^sticsindicateIL-18 do worthyresearching may onekindoft