四川省松树散斑菌的种类及其rrna基因its区的pcr、克隆和序列分析.pdfVIP

摘 要 同松树(云南松、华山松、马尾松、湿地松、油松、高山松等)、同一松树不同部位(树 冠中下部枝条、落地针叶)上的散斑壳菌进行了形态学种的鉴定，共发现散斑壳菌6种， 松针散斑壳 etLiu、 Qiu et 印度散斑壳Lophodermium．indianumSingh 了分离培养并对其产孢特性作了研究，发现带有病斑的针叶和培养物在8个星期内均没 有子囊果产生；但在人工创造的高湿条件下，带有成熟子囊果的松针很快释放出子囊孢 子并萌发。 采用改良氯化苄法，获得了7株散斑壳菌的基因组DNA。利用真菌通用引物ITSl 的特异性条带。然后将PCR扩增片段定向克隆到pUCm．T质粒的多克隆区，并转化到 大肠杆菌JMl09载体菌中，筛选获得阳性克隆菌株，最后对阳性克隆质粒中的外源DNA 比较，并构建了系统发育树，结果表明：这11个菌株可以分为3个大组，即前8株 间的同源率在90．0％左右，被归为第二组，它们与第一组各个菌株之间的同源率仅仅在 63．1％．79．3％之间。 列号分别为AY422489、AY5153t8、AY515319和AY422490。 关键词： 四川松散斑壳菌ITS区PCR克隆序列测定 2 前言 由散斑壳属Lophodermium spp．真菌引起的松落针病是一种世界性病害，目前对该病 的研究已经有160多年的历史，但是从上世纪70年代开始才有了比较系统的研究。该 中就可危害22个种3个变种和1个栽培变种[21，造成受害树木针叶提前脱落，树高、胸 径、材积生长均受到影响，严重者常造成毁产的损失【卦。松落针病在我国的发生历史非 常久远，但长期以来这类病害只被作为一般性叶部病害对待，没有受到应有的重视，也 没有进行深入细致的研究。进入20世纪80年代后，发生在我国樟子松、油松、红松等 松树上的落针病为害同益严重，给育苗、造林及林木生长造成了巨大损失，成为生产上 迫切需要解决的问题{4】。 四川省是我国的林业大省，森林总活立木蓄积量为14．65亿立方米，森林覆盖率为 24．23％，继黑龙江、西藏、云南之后而名列全国第四位。其中针叶林占有绝对优势，为 省内有林地面积和蓄积量的74．1％和82．0％t”，而针叶林中的松林又是本省分布最广的 森林类型，是主要的用材林和防护林。但目前在我省泸定二郎山、丹棱、雅安、蒲江、 资中、泸州、沐川、宜宾、巴中、西昌、广元、茂县等地的多种松林中，均发现不同程 度的松落针病。轻者造成针叶提前脱落，树势衰弱，严重者使得整株树木枯死，造成毁 产的损失，极大地影响了我省林业的健康持续发展。因此，我们以松落针病病原菌散斑 壳Lophodermiumspp为对象，对本省10县6市的松树林区进行了深入细致地调查，以 其形态特征和生物学特性为基础，并结合了分子生物学的鉴定方法——测定不同种散斑 壳菌rRNA基因ITS区序列，对四川省的不同种松树间、同一松树上不同种的散斑壳病 菌进行了系统的研究和明确的定种，以期为病害的防治及对该属病菌的进一步研究和利 用提供充实的理论依据。 1．文献综述 1．1散斑壳属真菌的分类研究概况 1．1．1散斑壳属的传统分类学 前人研究的基础上，对松树上的散斑壳进行了详细的分类研究，根据子囊果的外部形态 以及在子囊果中点作横切片时在寄主组织内埋藏的深度，盾状壳开裂区唇细胞的有无和 着色深浅，分生孢子器的有无和大小以在基物中的埋藏深度，针叶上横线纹的有无、颜 等人又发表2个新种。我国对该病的研究始于20世纪20年代。朱凤美1927年首次报 道我国湖北马尾松上由松针散斑壳L．pinastri引起的落针病t“。此后对我国多种松树上发 现的散斑壳菌都沿用这一静名。直到80年代由于病原菌的分类研究取得突破性进展， 从而促进了病理学的深入研究，并取得一系列的新进展，其中最大的特点