抗秦川黄牛成熟蛋白单克隆抗体的制备及鉴定.pdf

摘 要 【目的】本研究拟采用秦川黄牛重组成熟朊蛋白(PrP)的纯化复性产物作为免疫原，应用 淋巴细胞杂交瘤技术制备出抗牛成熟朊蛋白的单抗(mAb)，为研制疯牛病免疫诊断试剂 盒奠定基础。 r方法】将本实验室保存的含有秦川黄牛成熟PrP基因的重组质粒pET30a．PrPf25~242aa) 转入大肠杆菌叵co』j 采用Ni．NTA亲和层析法纯化融合蛋白，透析法复性纯化的重组表达产物，考马斯亮蓝染 色法测定蛋白浓度。以sAF70进口单抗为检测抗体，westemblot分析融合蛋白的免疫反 应性和对蛋白酶K的敏感性。以纯化复性的牛成熟PrP融合蛋白作为免疫原，以含有 JMl09(DE3)的菌体蛋白作为对照免疫原，分别与弗氏完全 pET30a(+)空载体的￡cD』j 第4周和第8周皮下注射同等剂量的以弗氏不完全佐剂乳化的免疫原，在第12周按150LL2／ 只剂量直接腹腔注射PBs稀释的免疫原。3d后取PrP融合蛋白免疫小鼠脾细胞与sP2／0 性对照，SP2／0细胞上清液l：1和对照免疫鼠血清1：960作阴性对照，加入辣根过氧化酶标 照3倍以上者初步判定为阳性克隆。将阳性克隆N64杂交瘤作有限稀释，3次亚克隆后液 氮冻存细胞并连续传代3个月检测杂交瘤分泌抗