dlx5基因促室管膜前下区神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性细胞分化的实验研究.pdf

贵阳医学院2014 届硕士研究生论文 目 录 摘 要 …………………………………………………………………… 1 前 言 …………………………………………………………………… 3 材料与方法 ……………………………………………………………… 5 结 果 …………………………………………………………………… 19 讨 论 …………………………………………………………………… 31 结 论 …………………………………………………………………… 35 参考文献 ………………………………………………………………… 36 英文摘要 ………………………………………………………………… 40 致 谢 …………………………………………………………………… 42 略缩词表 ………………………………………………………………… 43 论文原创性说明 ………………………………………………………… 44 附：综述 ………………………………………………………………… 45 万方数据 贵阳医学院2014 届硕士研究生论文 Dlx5 基因促进室管膜前下区神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性细胞分化 的实验研究 专业：人体解剖与组织胚胎学 研究生：胡兴峰 导师：高方友教授 余资江教授 【摘要】 目的 体外分离培养出生24h 内SD乳鼠室管膜前下区（Anterior subventricular zone ，SVZa ）神经干细胞( Neural stem cells ，NSCs) ，通过基因转染 等方法研究Dlx5 （distall-less homeobox 5 ）基因对SVZa NSCs 向酪氨酸羟化酶 （Tyrosine hydroxylase,TH ）阳性细胞分化过程中的影响。方法 （1）构建一个重组 腺病毒穿梭载体质粒pDC316-mCMV-EGFP-mDlx5及对照重组腺病毒包装；（2 ）利 用细胞培养技术对SVZa NSCs进行分离培养及传代，用免疫荧光细胞化学方法鉴定 其干细胞特性及分化潜能；（3）利用基因转染、RT-PCR等方法检测重组质粒在SVZa NSCs 中的表达情况；（4 ）用荧光标记方法观察转染的神经干细胞分化后的形态特点 及鉴定分化细胞的类型,以了解与神经元分化的关系；（5 ）转染Dlx5基因的SVZa NSCs分化后，用多巴胺（DA ）能神经元特异性标记物即酪氨酸羟化酶（TH ）免疫 组化染色，以了解转染后的NSCs分化成TH 阳性细胞的比例。结果 （1 ）成功构建 重组腺病毒质粒pDC316-mCMV-EGFP-mDlx5 ，插入786bp片段与已知小鼠基因同源 性为100%，没有开放阅读框的移位；（2 ）原代培养的SVZa神经细胞球nestin免疫荧 光表达阳性，分化培养基诱导其分化后的神经细胞NSE 、GFAP 、CNP免疫荧光均表 达阳性；（3）重组腺病毒载体质粒转染SVZa NSCs后，8h 出现少量绿色荧光，16h 开始增多，48h到高峰，并能够稳定表达较长时间；RT-PCR检测到转染24h后的神经 细胞有外源转染基因的mRNA表达，说明构建的重组腺病毒载体质粒可以在SVZa NSCs 中稳定表达；（4 ）基因转染后神经细胞按形态特征分两类：第1类细胞突起从 胞体分别向两个相反方向伸长，形成两极，无或少分支；第2类是从胞体一端发出 一条较长的突起，类似神经元的轴突，其他突起则细、短。通过NSE免疫荧光证实 为神经元样细胞，TH染色证实能够分化成TH 阳性细胞；（5 ）常规传代培养诱导分