dna甲基化介的mage-a1基因在肝癌细胞中转录沉默的初步研究.pdfVIP

DNA甲森化介寻璐ALAGE--Al盖.准扮盛臼脸+肠云讯反肠台步研宪 +我摘要 中文摘要 肿瘤抗原MAGE-A1(MelanomaAntigen,FamilyA,1)在多种肿瘤中都有 表达，而在除皋丸之外的正常组织中不表达。因此，这种肿瘤特异性表达就使得 MAGE-AI成为一个可以运用于肿瘤基因治疗的候选基因。 在肝细胞肝癌中，MAGE-AI常过量表达，并在启动子区域呈低甲基化状态; 为了解DNA甲基化介导的基因沉默机制，我们从如下几方面分析了细胞中基因 启动子的功能:(1)应用半定量RT-PCR检测该基因在肝癌细胞株中的表达水平; (2)应用甲基化特异性PCR(MethylationSpecificPCR,MSP)检测该基因启动 子区CpG岛在肝癌细胞株中的甲基化状态;③应用甲基化特异性PCR检测CpG 岛中各个位点在BEL-7402和HepG2中的甲基化状态;(4)应用体外甲基化配合 定点突变的方法，通过瞬时转染与荧光素酶报告基因检测，确定5个特殊CpG 位点的关键性;(5)通过5一缺失突变与连接扫描突变的方法，通过瞬时转染与荧 光素酶报告基因检测，进一步分析了与该基因表达调控有关的启动子的关键序 列:(6)应用电泳迁移率改变实验 (ElectrophoresisMobilityShiftAssay,EMSA) 寻找与一30位CpG位点附近序列结合的核蛋白。 在对MAGE--AI基因的转录调控机制的研究中，我们发现: 1.在所检测的4株肝癌细胞株中MAGEAI启动子的去甲基化状态与该基 因在细胞中的表达相关，且该基因的转录受到DNA甲基化的调控: MAGEAI启动子的一81和一30位CpG位点比较重要; 最小启动子片段为一56-+263 4.一个新的序列特异性的DNA一蛋白结合在DNA甲基化介导的MAGE-AI 基因转录沉默中起了重要作用，结合序列在一30位 (相对于转录起始点). 我们的结果不仅提供了DNA甲基化介导基因转录调控的新视角，因为它在 肿瘤中去甲基化而在正常组织中高甲基化:而且为将来用AMGEAI作为模型， 描绘转录调控的表观遗传学机制铺平了道路，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和 染色质重构。 关键词:MAGEAl甲基化转录调控 友旦大学医学此 上海市钟劝研究研 硕士掩丈 .. DNA甲东化介寻幼MACE-AI盖目在歼摘归施中特旅肠反璐匆夕研究 Abstract ThecancerantigenMAGE-A1(MelanomaAntigen,FamilyA,1)isexpressedin manykindsoftumor,butitisnotexpressedinnormaltissueexceptintestis. Therefore,thetumorspecificexpressionhasmadetheMAGE-A1becomeacandidate geneforcancergenetherapy. MAGEA1genethatwasover-expressedandrfequentlyhypomethylatedatthe CpGislandofpromoterinhumanhepatocellularcarcinoma.Tounderstandthe DNA-methylationmediatedgenesilencingmechanisms,weanalyzedthepromoter functionincellcultureatthefollowingaspects:0tomeasuretheexpressionstatusin apaneloftheestablishedlivercancercelllinesbyuseofsemi-quantitivereverse transcriptionPCR (RT-PCR);0tomeasuretheDNAmethylationstatusofthe promoterCpGislandinestablishedlivercancercelllines妙useofmethylation specificPCR(MSP);0tomeasurethemeth