htert rai和外源性puma基因联合作用促mcf-7细胞凋亡机制的初步研究.pdf

／删㈣㈣ hTERT ， 凋亡机制的初步研究 摘要 因联合作用促MCF．7细胞凋亡的可能机制，为hTERT基因干扰和外源性 PUMA基因联合作用作为肿瘤基因治疗策略的应用提供依据。方法：根据 成具有该靶序列短发夹结构的寡核苷酸，退火形成双链DNA，并定向克隆 挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增，并抽提纯化质粒，然后将抽提的重组质 粒进行SacI酶切和琼脂糖电泳分析，同时做测序鉴定以确定插入的干扰片 段准确无误。同法构建不针对任何基因的shRNA阴性对照质粒 bank pYr-2．1．HK。将PUMA基因序列(gene DH5a，经Kana。抗性筛选，挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增，并抽提纯化质 粒，然后将抽提的重组质粒进行BamHI和EcoRl双酶切和琼脂糖电泳分析， 同时做测序鉴定以确定插入的PUMA基因片段准确无误。用表达绿色荧光 中进行转染(空白对照组不加任何试剂)，联合组每孔 48h裂解各组细胞提取总蛋白，通过Westernblot检测各组细胞hTERT、 计位点，重组质粒构建成功。 EcoRI双酶切鉴定和测序鉴定证实目的序列已准确插入到预计位点，重组质