低水平碳离子束射所致超敏感现象及其机制的体外研究.pdf

低水平碳离子束照射所致超敏感现象及其机制的体外研究 中文摘要 中文摘要 目的：除本底之外，宇宙探索、核能开发、医疗照射等活动均使人类有更多 的机会暴露于低水平的辐射环境。低剂量辐射生物学效应一直以来都是放射医学 研究的一个热点。近年来的研究发现了几个特殊的低剂量效应，这些效应包括适 应性反应、旁观者效应、基因组不稳定性和低剂量超敏感现象等。其中辐射低剂 量超敏感现象是指低剂量电离辐射（ 0.5Gy ）单位剂量的细胞杀伤比高剂量时更 有效，这被称为“辐射超敏感性”（Hyper-Radiosensitivity, HRS ），此后，随着照射 剂量的增加，细胞对电离辐射的抵抗性逐渐增强，直到 1Gy 为止，这随后的效应 被称为“诱导的辐射抗性”（Induced Radioresistance, IRR ），因此辐射低剂量超敏 感现象也称为 HRS/IRR 现象。HRS/IRR 现象目前主要集中在体外低 LET 射线的细 胞杀伤效应方面的研究，其机制认为是与 ATM 基因有关。该现象在高 LET 射线 中研究较少。重带电粒子（重离子）因其不同于其它粒子和射线的物理学特性， 较常规的Χ 、γ射线和电子束等在肿瘤治疗方面有更明显的优越性。目前许多国家 都已经开始考虑将重离子束（主要为碳离子束）作为今后临床肿瘤放射治疗的一 种新手段。在这种治疗模式下，受照射的肿瘤部位被置于 Bragg 峰处，从而在肿 瘤接受较大剂量情况下，其前方正常组织接受较小的剂量。本课题的研究目的为 初步探讨暴露于低水平碳离子束辐射下的正常细胞是否存在超敏感的现象，以及 这种现象的发生机制，为今后采用碳离子束治疗肿瘤时的方案制定以及相关防护 提供一定的基础研究资料。 方法： 第一部分：低水平碳离子束照射人正常细胞的超敏感现象研究 采用传统的克隆形成实验检测受低水平碳离子束照射后细胞的存活分数，采 取克隆法检测受照细胞的 hprt 基因位点突变频率。首先采用低水平Χ射线照射正常 人皮肤成纤维细胞 GM0639 （GM 细胞，ATM+/+ ）。在确认其存在低剂量超敏感现 象的基础上，选择 0.05～2Gy 照射剂量范围的碳离子束（能量：290 MeV/nucleon ， LET ：70 keV/μm ，剂量率：0.5 Gy/min ），观察 GM 细胞在低水平碳离子束照射下 的细胞存活分数和hprt 基因位点突变频率指标是否存在 HRS/IRR 现象。另外还观 察了低水平碳离子束照射下 ATM 缺陷型的人皮肤成纤维细胞 AT5BIVA （AT 细胞， I 中文摘要 低水平碳离子束照射所致超敏感现象及其机制的体外研究 ATM-/- ）各检测指标是否存在超敏感现象，以初步探索低水平碳离子束照射下 HRS/IRR 现象的作用机制。 第二部分：重离子照射所致超敏感现象 ATM 相关机制的探讨 首先，选用 ATM 激活剂，Chloroquine，或者ATM 抑制剂，KU55933 在碳离 子束照射前处理 GM 细胞，随后用低水平碳离子束进行照射，观察受照后细胞的 存活分数和 hprt 基因位点突变频率指标的 HRS/IRR 现象是否仍存在。采用 Western blotting 方法观察 ATM 的表达随着照射剂量变化的情况，初步确认ATM 是否可能 参与低水平重离子束 HRS/IRR 现象的发生机制。 其次，根据之前相关机制的报道，结合 ATM 蛋白具有调控细胞周期以及 DNA 修复的两个最基本功能，通过这两方面来进一步探讨 ATM 是如何在其中发挥作用 的。 细胞周期调控：采用免疫荧光染色结合流式细胞仪的方法，观察 Histone H3-pS10 随着不同的照射剂量以及不同的照射前预处理而变化的情况，通过计算有 丝分裂指数，反映“早期”G2 调控点的阻滞情况；同时还采用流式细胞仪观察细 胞周期的分布，反映照射后一定时间 G2/M 调控点的阻滞情况。并且还采用 Western blotting 检测周期调控相关基因的表达情况。 DNA 修复调控：首先采用免疫荧光染色的方法，观察 γ-H2AX 荧光焦点