大鼠神经干细胞体外培养及向神经元的诱导分化.pdf

中 文 摘 要 大鼠神经干细胞的体外培养及向神经元的诱导分化 摘 要 神经干细胞的发现，更新了以往认为神经元不能再生的传统观点，使 人们对神经系统的结构和功能有了一个全新的认识。神经干细胞不仅可以 外为研究神经发育的模型，并且，作为潜在的移植细胞的来源，为临床治 疗神经系统疾患提供了一个新的有效治疗途径。如果神经干细胞能像造血 干细胞那样得到深入研究，并且能够大量获得，进而异体移植成功，必然 会对医学进步起重人的推动作用。目前，关于神经干细胞的研究虽然很多， 但距离实际应用还有很大的差距。因此，选择神经干细胞作为研究对象， 对体外培养的神经干细胞的生长特性，形态结构进行较深入的研究;并探 讨诱TI神经干细胞向神经元定向分化的有效方法;同时检测神经干细胞III DNA拓扑异构酶11的表达情况，期望能够找到调控神经干细胞增殖和定 向分化的新切入点。本研究分四部分。 第一部分:大鼠神经干细胞体外生长特性 目的:介绍 一种较成熟的大鼠神经干细胞体外培养方法，并观察其体 外生长特性。 方法: 1神经干细胞的分离培养 取新生大鼠(ld之内)侧脑室前角周围的脑组织，川EDTA:胰蛋白酶 (1:1)消化，制成单细胞悬液，接种于无血清培养基(含B27和20ng/ml bFGF,20ng/mlEGF的DMEM/F12培养基)中，观察神经干细胞的体外 生长过程,)牛比较不同接种密度，不同传代时间对神经十细胞生长的影响。 2大鼠神经干细胞的鉴定 2.1nestin免疫细胞化学:取传至第3代细胞，传代后3d，做nestin免疫 细胞化学，一抗为兔抗鼠nestin多克隆抗体 (1:50),40C,24h;FITC 标记的二抗 (1:30),370C,2h. 2.2生长曲线绘制:取传至第3代的神经干细胞，以5X10$个细胞/ml密 中 文 摘 要 度接种到%孔板中，每孔200u1。用MTT比色法测定细胞的生长曲线。 2.3诱导分化:将神经球接种于用多聚赖氨酸(PLL)包被的盖玻片上，培 养液中加入1%胎牛血清和lOng/ml胶质细胞源性生长因子 (GDNF)037 ℃，5%CO:饱和湿度培养箱内培养7d。爬出细胞做GFAP(星形胶质细 胞特异性标记物)和 NSE(神经元特异性标记物)免疫细胞化学进行细 胞定性。观察神经干细胞的分化潜能。 3AO/EB染色 培养的神经干细胞，用叮咙橙 (AO)/澳化乙咤 (EB)混合荧光染液 染色，检测细胞活性。 4荧光标记 用DAPI荧光染料标记细胞，观察细胞的标记率。检测标记后细胞的 生长 曲线。传代 1个月后，观察细胞的标记效果。 结果: 1体外培养的神经干细胞聚合成神经球，悬浮生长。细胞接种密度为 5X1护个细胞/ml组，接种后 3-4d可形成典型的神经球 (呈规则圆形， 细胞之间连接紧密)，大小不一，直径5-10jim。神经球外围分布有一层 大小较均匀，生长状态良好的细胞;接种后9d，神经球土可见黑色斑块。 接种密度为1X105个细胞/ml组，相同时间所形成的神经球体积小，数I=1 少，以单个细胞为主。 接种后3-4d传代，可继续获得大量生长状态良好的神经球，细胞倍 增时间为2d。接种后9d传代，传代后细胞生长状态不佳，细胞倍增时间 接近 5d. 2所培养细胞呈nestin阳性，具有增殖能力。加入血清和GDNF诱 导分化后，细胞贴壁生长，体积增大，并发出形态各异的突起。可见GFAP 和NSE阳性细胞。 3神经球成分复杂，外围为体积小而圆的细胞，中间为有突起的细胞。 AO/EB染色显示，原代培养3-5d时，神经球内的细胞主要为活细胞;培 养时间过长后神经球内可见死细胞。DAPI标记率为 100%，标记后细胞 生长曲线变化不大。体外培养 1个月后仍可检测到荧光。 结论:培养细胞经鉴定为神经干细胞。本方法简单、易操作，可行性 强。神经干细胞要高密度接种，及时传代。神经球成分复杂。DAPI可作 中 文 摘 要 为有效的体外标记物。 第二部分:体外培养的神经干细胞聚集体结构分析 目的:观察大鼠神经干细胞聚集体的内部结构并分析其细胞组成。