天花粉蛋白的抑性t细胞和表位携带肽段的研究.pdf

中文摘要 kirilowii) 的块根中提取的一种由247个氨基酸残基组成的碱性植物蛋白，等电点为9．4，分 子量为24kd左右。这一植物蛋白由我国学者最早分离，进行过一系列生物化学和 物理化学方面的研究，并作为引产药物在临床上广泛使用。天花粉蛋白生物学活 性方面的研究工作主要围绕以下两方面。首先，天花粉蛋白具有一系列以负向调 节为主的特性已经为人们所认识，包括引产(破坏滋养层细胞)、抑制肿瘤细胞增 殖、抑制病毒(HBV和HIV)在体外的复制和诱导细胞凋亡。同时，天花粉蛋白 也具有一系列正向调节免疫应答的能力，人们发现在临床应用上，天花粉蛋白可 以引起过敏反应，有多个实验室就天花粉蛋白诱生kE抗体产生及其机理也展开 了深入的研究。 r＼ 一I我们实验室对天花粉蛋白的研究主要围绕着天花粉蛋白的一个新的特性一诱 ＼ 发免疫抑制而展开。前期工作中我们曾经观察到，在淋巴细胞的体外增殖体系中 加入微量的天花粉蛋白可以有效地抑制淋巴细胞的增殖，而且这一免疫抑制可以 经由细胞介导。将PBL用天花粉蛋白脉冲处理后并将天花粉蛋白洗净，导入抗原 诱导的淋巴细胞增殖系统中，增殖即可以剂量依赖的形式受到抑制，提示诱导的 免疫抑制是由天花粉蛋白激活的免疫细胞引起。另一个事实是，将CD8+细胞从 PBL中剔除，发现可以部分缓解天花粉蛋白所诱导的免疫抑制。而用氯喹等抗原 递呈阻断剂处理PBL，天花粉蛋白就不能经由这些细胞有效地诱导免疫抑制。诸 多现象证明：天花粉蛋白诱导的免疫抑制有抑制性淋巴细胞群体的参与，并与抗 原递呈相关。 关于天花粉蛋白诱导免疫抑制的机理研究中仍有一些问题悬而未决：例如， 在天花粉蛋白全长序列中，是否存在能够阻止淋巴细胞增殖的抑制性肽序列?在 确认天花粉蛋白诱导的免疫抑制可以为细胞介导的条件下，到底是那一类淋巴细 胞发挥抑制作用，它们的免疫生物学特性是什么?对此，本论文开展相应研究。 一、天花粉蛋白全长基因的分段克隆、表达和鉴定： 有关天花粉蛋白抑制淋巴细胞的增殖的机理推测有以下几方面：首先，天花 inactive 粉蛋白是一种I型核糖体失活蛋白(ribosome 系中可专一水解28S核糖体RNA中的腺苷酸，使其失去嘌呤而抑制蛋白质的生物 合成。同时天花粉蛋白在体外可以诱导肿瘤细胞凋亡，这些负向机制都可能成为 天花粉蛋白抑制淋巴细胞增殖的原因。但是这些机制都依赖于天花粉蛋白完整的 蛋白质构象。我们所关注的是天花粉蛋白的全长序列中是否存在着可以诱导免疫 抑制的肽序，这些肽段通过APC递呈给T细胞，以某些未知的途径调节T细胞的 激活或抑制T细胞的增殖。如果天花粉蛋白可以在体外抑制病毒的复制，而一些 病毒(如HIV)的复制依赖于T细胞的激活，揭示这些肽序，有助于在保留天花粉 蛋白有效的病毒抑制功能的前提下，去除其细胞毒性，降低其使用时诱发的毒副 作用，使之成为治疗艾滋病和自身免疫性疾病的理想候选药物。 基于天花粉蛋白的全长序列我们设计了三个序列部分重叠的重组片段： 段的形式在原核表达系统中进行表达，经过纯化后，得到失去原有空间构象和不 具有RIP活性的三个独立的片断，以初步确定抑制性表位的所在，三个重组肽段 抑制活性的测定结果表明：(1)它们对抗原特异和丝裂原诱导的淋巴细胞增殖的抑 制能力弱于全长蛋白，但是三个重组蛋白片段都保留不同程度的抑制能力，提示 其抑制性表位可能分布于整个序列的不同位置。(2)正常个体间对三个片段的应答 格局(抑制强度)有较大的差异，这可能和个体间有不同的遗传背景有关，因为 我们以前的工作表明：天花粉蛋白的抑制作用受HLA—DQ等位基因的调控。 二、天花粉蛋白全长序列中抑制性肽序的确定： 为了进一步对抑制性肽序进行精确的定位，我们用mutilpin技：术合成了基于全 个氨基酸的重叠。在多个个体中，我们观察了这些合成肽对PHA和抗CD3单抗诱 2 系增殖的影响。我们发现：天花粉蛋白全长序列上存在两个主要的抑制性部位 EB病毒转染的B细胞系，以及肿瘤T细胞系的自发增殖发挥抑制作用，提示这些 小肽是通过免疫调节作用而非通过非特异的细