小鼠甘露聚糖结凝集素（mmbl-a、mmbl-c）的克隆与表达及其功能研究.pdfVIP

硕士学住论文 小鼠甘露聚糖结合凝集素 (mMBL．A，mMBL．c)的克隆与表达 及其功能研究 硕士研究生：左大明 指导教师：陈政良 摘要 甘露聚糖结合凝集素(mannanlectin，MBL)为肝细胞分泌的一种 binding 血浆糖蛋白，属于C型凝集素超家族中胶凝素家族的成员，是天然免疫系统中 重要的模式识别分子。成熟MBL肽链自N端至C端依次有4个结构域：富含 Cys的N端区、胶原样区(collagen．1ikeregion，CLR)、颈区和C端糖识别域 domain，CRD)。MBL在机体抗感染天然免疫中起 (carbohydrate．recognition 重要作用。它利用CRD选择性识别和结合多种病原体如细菌、病毒、酵母、利 什曼原虫表面的糖结构，又藉其CLR经由凝集素途径激活补体系统，发挥溶菌 或间接调理吞噬功能，还能与吞噬细胞表面的胶凝素受体(即C1q受体)结合， 起直接调理作用。然而，认识对MBL结构与功能有一些了解，但MBL分子的 结构一功能关系及其生物学功能与机制亟待探索。 人类的MBL只有一种成分，而大鼠、小鼠、家兔和恒河猴体内存在2种不 水平上具有很高的同源性。鉴于mMBL与hMBL结构的高度同源性及其在分布、 生物学活性方面的诸多相似，小鼠无疑是研究MBL结构、功能及其机制的良好 模型。 第1章Balb／C小鼠MBL基因的克隆 5．0软件，设计并 根据已发表的mMBL的cDNA序列，采用Primerpremier 因cDNA片段，克隆入pUCm—T载体，PCR鉴定并测序。阳性质粒分别命名为 摘要 pmMBL—A与已发表序列仅1个碱基不同(其426位碱基由A变为G)，两者的 同源性达99．9％。结果表明我们成功获取了小鼠MBL基因，为进一步的研究奠 定了基础。 第2章小鼠MBL糖识别域的原核表达和相关抗体的制备 分别表达小鼠MBL．A和MBL—C的CRD，并制备相关抗体。(1)利用PCR 要以包涵体的形式存在，其相对分子质量(肋‘)分别为47000、44000和34000。 用梯度透析法进行复性，然后纯化蛋白，以ELISA鉴定表达蛋白具有糖结合活 性。(2)对小鼠MBL—A的B细胞优势表位进行预测，合成B细胞识别表位短 肽，将其与载体蛋白交联制备免疫原，免疫家兔获得相应抗血清，经ELISA检 测其滴度为1：256000。采用SPG柱对所得抗血清进行纯化，ELISA分析显示所 得抗体可与mMBL—A 的表达产物免疫家兔，分离血清后，以pET32a．mMBL—C．CRD表达产物进行 ELlSA，其抗体滴度为1：256000，采用亲和层析对所得抗血清进行纯化，Western blot实验结果显示多克隆抗体能够与mMBL．CCRD蛋白特异性结合。 第3章mMBL．C抑制痢疾杆菌侵袭小肠黏膜的研究 通过ELISA方法鉴定重组mMBL—CCRD蛋白与福氏痢疾杆菌2a裂解物的 结合，以FITC和TRITC分别标记重组mMBL—CCRD蛋白和痢疾杆菌进行结合 试验观察重组蛋白与细菌的结合，发现重组CRD蛋白可与痢疾杆菌及其裂解物 结合，该作用是Ca2+依赖的，且抗mMBL—CCRD多克隆抗体能阻断mMBL—C CRD蛋白与痢疾杆菌的结合。 用2×10”个具链霉素耐药性的痢疾杆菌2a经口服攻击小鼠，建立小鼠肠 道细菌感染模型。感染前2d，经口服给予小鼠5 mg硫酸链霉素和lmg红霉素 并禁食1d，在整个实验过程中喂食含4 h，通 g／L硫酸链霉索的纯水。攻击前2 过静脉注射和口服2种途径分别给予小鼠抗mMBL-CCRD多克隆抗体各0．2