猪瘟rt-pc elisa试剂盒的研制.pdfVIP

摘要 本研究结合了标记地高辛的RT-PCR技术平¨生物索标记的探针杂交技术。成功建立了一种 检测猪瘟病原的RT-PCRELISA方法，组装了试剂盒，并进行了初步应用。 从5’--UTR(Un-translated region)区域设计了特异性的引物和捕获探针，在PCR过程中 加入了地高辛标记，将探针作生物素标记。利_I{j链亲和素包被的ELISA酶标板与生物素标记 的探针特异性结合，而探针义特异性地与标记了地高辛的PCR产物相结合，最后采用抗地高 件，确定了最佳的1：作浓度与温度以及反应时间。本研究结果表明：链亲和素的最佳包被浓 物酶的稀释浓度为1：3000．最佳的杂交温度为50C，最佳的杂交时间为30--60分钟。 对试剂盒内试剂的保存作了防腐剂选择实验和保存期试验，结果表明在试剂盒保存了10 个月以后，阴阳性对照仍然成立。在防腐荆叠氮钠和柳硫汞酸钠的选择实验中发现叠氮钠对 酶有一定影响，大大降低了实验OD值，冈此选择柳硫汞酸钠作为试剂盒的防腐剂。采用本实 验建立的试剂盒对来白北京二个猪场50头份病料进行了检测，结果发现有36头份为阳性， 14头份为阴性。 本研究建立了一种快速、敏感、特异的猪瘟RT-PCR