槟榔碱对上皮细周期、凋亡、恶性转化影响的初步研究.pdfVIP

摘 要 背景与目的 submucousfibrosi 口腔黏膜下纤维性变(oral s，OSF)是一种 慢性、隐匿性且具有癌变潜能的口腔黏膜疾病。OSF癌变率高达7．6％。 咀嚼槟榔是0SF病变及癌变的主要原因，槟榔已被国际癌症研究中心 认定为I级致癌物。临床上多数0SF患者口腔黏膜上皮萎缩，胶原堆积， 仅少数患者上皮组织出现增生，在OSF癌变的组织中既有上皮萎缩又 有上皮组织增生或两者并存。研究还发现0SF及癌变组织中细胞周期 和凋亡相关蛋白表达异常。槟榔碱是槟榔的主要成份，槟榔碱在上皮 萎缩与上皮组织增生中起何种作用及其作用机制有待研究。 本研究以人永生化上皮细胞Hacat和人胚肺成纤维细胞Hel为模 型，首先观察短时间高剂量槟榔碱刺激下对这两种细胞存活率，细胞 周期和细胞凋亡的影响，初步探讨槟榔碱致上皮组织萎缩的分子机 制。进一步，研究长时间低浓度槟榔碱诱导下对上皮细胞Hacat细胞 周期、细胞迁移能力等恶性转化相关生物学特性改变的影响，为槟榔 碱致0SF上皮组织病变及其癌变的发病机制提供一定的理论依据。 方法 。 1．研究短时间高剂量槟榔碱刺激对上皮细胞Hacat和成纤维细胞Hel 的细胞毒性作用： 槟榔碱对细胞存活率的影响；流式细胞术检测槟榔碱对细胞周期及凋 亡的影响；然后采用RT—PCR、Westernblot检测细胞周期相关调控蛋 白的mRNA和蛋白表达水平的差异；Westernblot检测细胞凋亡调节的 相关分子；琼脂糖凝胶电泳检测槟榔碱诱导下凋亡细胞DNA切割形成 的DNA 响；C0一IP实验检测槟榔碱对CyclinDl的泛素化调节。 2．检测低浓度槟榔碱长时间诱导下上皮细胞Hacat周期及迁移能力等 与细胞恶性转化及癌变相关生物学特性的改变：MTT检测低浓度槟榔 blot 碱诱导不同时间对细胞存活率的影响；报告基因实验、Western blot检测姗P一9蛋白的表达，RNAi实验初步确定槟榔碱诱导下调控 姗P一9表达的转录因子：Transwell实验检测低浓度槟榔碱对上皮细胞 Hacat运动能力的影响。 仕甲 ：口木 1．MTT实验结果：50“g／m1及以上槟榔碱作用24h时明显抑制上皮细胞 度才影响成纤维细胞Hel的存活，且无时间依赖性。20“g／ml槟榔碱作 用2m，3m，4m，5m时促进上皮细胞Hacat存活(PO．05)。 2．流式细胞术结果显示：75，100，125¨g／ml槟榔碱干预上皮细胞12 小时将周期阻滞于Gl／S期，而对成纤维细胞Hel周期无明显影响；50， 并呈剂量依赖性，随浓度升高，晚期凋亡细胞的比例也不断上升。 3．Western 达；并促使晚G1周期素依赖的蛋白激酶CDK2及E2F1的表达下调；而对 控蛋白CyclinB／CDC2表达影响不明显。 制上皮细胞HacatCyc 诱导4m，5m后逐渐上调CyclinDl启动子活性(PO．05)。 5．C0一工P实验：O，25，50，75，100， 125“g／ml的槟榔碱干预上皮细 linDl的泛素化，促进其泛素化降解。 胞Hacat24h诱导Cyc 6．Western 小时上调促凋亡基因Bax并抑制抗凋亡基因Bc卜2的表达；25，50，75， 100／m1槟榔碱干预24小时促进caspase一3的表达上调并诱导其活化； 的表达上调并诱导其活化。 7．Western Ⅱ 24hNF—K 上皮细胞Hacat 处理NF—K B、AP一1、Ets一1三种转录因子后50¨g／m1槟榔碱干预上皮细 24h 胞HacatMMP一9表达下调，其中NF-KB的诱导效应最明显。 皮细胞Hacat的迁移能力。 结论 1．短时高浓度槟榔碱能抑制上皮细胞存活，并将其阻滞于G1／S期主要 细胞CyclinDl的启动子活性，诱导其蛋白发生泛素化降解；诱导上皮 细胞凋亡，促进cas