丙型肝炎病毒核蛋白编码基因鉴定与表达研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 丙型肝炎病毒核心蛋白编码基因鉴定与表达研究 目 的 蛋白，为HCVC蛋白功能研究奠定基础。 材料与方法 一、实验材料 1、细胞： hamster 中华仓鼠卵巢(Chineseovary,CHO)细胞购于中国科学研究院上海 细胞库。 2、质粒及菌株 含HCV C基因全长体系重组质粒pCMH6K由冯国和构建，感受态菌DH5a 购自Takara公司。 3、主要试剂 No．DV801A)、限制性内切酶BamHl 质粒小剂量提取试剂盒(Takara，product modified medium)，10％胎牛血清(fatalcalfserum，FCS)，青、链霉素均购于海科隆 eagle 司． 二、实验方法： 1、pCMH6K转化与鉴定 从．80。C冰箱中取出冻存的感受态细胞，冰上解冻并转化pCMH6K，参照Takara 试剂盒说明书，小剂量提取pCMH6K并经BamHl酶切电泳鉴定。 2、pCMH6K瞬时转染CHO细胞 细胞。取对数生长期CHO细胞消化并接种子六孔板，每孑L0．5ml，在37℃，5％C02 的条件下常规培养24h，直至细胞融合达到90％以上。配制脂质体／质粒混合物： 将10ul脂质体加入240ulDMEM中，轻轻混匀，室温孵育5min。混合溶液A与 溶液B，室温孵育20min(此时溶液变浑浊)形成脂质体／质粒混合物。用无血清 无抗生素的DMEM洗细胞2次，加入脂质体／质粒混合物于六孔板，加入无血清 继续72h。 3、免疫荧光检测 6孔板常规培养pCMH6K转染的CHO细胞，待细胞密度达到70％时，4％的 多聚甲醛固定1h；0．1％的Triton溶液打孔10mira0．I％BSA封闭lh；山羊抗鼠 光显微境下观察细胞并拍照。 实验结果 l、所克隆的HCV C蛋白编码基因经酶切、电泳分析为573bp。 2、pCMH6K转染的CHO细胞胞浆及胞膜可见绿色荧光表达。 结论： C蛋白编码基因。 1、转化的pCMH6K经酶切、电泳鉴定含有HCV C蛋白，主要表达在胞浆与胞膜。 2、pCMH6K转染的CHO细胞可表达HCV 关键词 丙型肝炎病毒；核心蛋白；免疫荧光 2 ·英文论著摘要· Geneidetificationand of of expressioncodinggene core Cvirus protein hepatitis 0blectlve U inchinahamster cviruscore is cell，in Hepatitis proteingeneexpressed ovary fortheresearchofthefunctionof