nyd-sp5因在小鼠睾丸中的表达及nyd-sp5干扰载体的构建.pdfVIP

·中文论著摘要· 载体的构建 目 的 基因NYD．SP5是Lan．LanⅥn掣11在人睾丸eDNA mieroarray差异杂交的基础 上，克隆的一个新的成人睾丸高度表达的基因。它由3598个核苷酸组成，包括 1027个氨基酸开放阅读框架。序列分析显示基因NYD．SP5与小鼠睾丸基因 性。这表明基因NYD．SP5是一条人．小鼠同源基因。结构域分析推测NYD．SP5蛋 白是一种跨膜蛋白。 本研究用免疫组化和原位杂交方法研究了基因NYD．SP5在小鼠睾丸组织中 粒。为下一步建立基因NYD．SP5的转基因小鼠模型及研究该基因的功能奠定了基 础。 方法 用原位杂交法研究小鼠睾丸组织中NYD．SP5mRNA的表达及定位；用免疫 组化法研究小鼠睾丸组织中NYD．SP5蛋白的表达及定位。构建基因NYD．SP5的 mRNA序列，设计有小发夹结构的4 4个pGPU6／GFP．shRNA载体。根据NYD．SP5 条寡核苷酸序列，克隆到空载体pGPU6／GFP中，构建重组质粒，提纯及鉴定重组质 粒，同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照，不针对任何特异基 因的质粒作为阴性对照。通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆。 结 果 原位杂交技术显示，在小鼠睾丸生精小管上皮的生精细胞细胞质中实验组有 mRNA存在于小鼠睾丸 棕黄色的染色，对照组未见棕黄色染色，说明NYD．SP5 生精小管上皮的生精细胞中。免疫组织化学分析发现，在小鼠睾丸生精小管上皮 的生精细胞胞质及管腔纤毛中，实验组有棕黄色染色，对照组未见棕黄色染色， 说明NYD．SP5蛋白主要存在于小鼠睾丸生精小管上皮的生精细胞及管腔纤毛中。 酶切电泳分析以及插入基因的序列分析证实，我们设计的碱基序列成功插入到了 预计位点。经重组质粒筛选，重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相 同，均证实重组质粒构建成功。 当日结论◆匕 小鼠睾丸生精细胞中存在NYD．SP5 mRNA和蛋白表达，提示该基因可能对精 子的发生发挥作用。利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向NYD．SP5的发夹结构 小干扰RNA表达载体。本研究为下一步建立基因NYD．SP5的转基因小鼠模型及研 究该基因的功能奠定了基础。 关键词 基因NYD．SP5、RNA干扰、shRNA、质粒、小鼠睾丸 2 ·英文论著摘要· in ofNYD·-SP5 mousetestisand Expression gene NYD．．SP5 establishmentof interferencevector ob ．i ． SP5isa found thatis inhumantestis[11．It newly gene highlyexpressed the1027amino consistsof3598 acid frame．Gene nucleotides，including openreading reveal