磁微粒发光免疫解析.ppt

概念和原理 概念：化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法 原理：磁微粒是指磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料。由于磁微粒具有磁响应性，成本低、能耗少和无污染等特点，人们在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团（如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等）将酶、抗体、寡核苷酸等生物活性物质进行固定，可进一步用于酶的固定化、靶向药物载体、细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化及杂交检测等领域。　　传统的免疫学检测多以酶标板为固相载体，悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较之酶标板载体具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性等优点，目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。 磁性微粒子发光免疫技术的优越性 磁酶免化学发光免疫分析法综合采用了目前国际上的两大主流免疫分析尖端技术—悬浮磁微粒载体技术、化学发光检测技术，使系统能够充分满足临床对检测结果的要求： ? 磁性微粒子d7u ? 扩大表面积、增加灵敏性 ? 加快反应速度、迅速捕获抗原、抗体 ? 易于结合相、游离相的分离，提高准确性 ? 提高发光强度、快速达到稳定、持续发光 分析步骤 磁微粒化学发光 该免疫分析技术有两种方法： 一是小分子抗原物质的测定采用竞争法； 二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。 该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。 其反应基本过程：（1） 双抗体夹心法：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。 （2）竞争反应：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记碱性磷酸酶的抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式。 ●磁微粒化学发光--双抗体夹心法：? ?　　?待测抗原同荧光素（异硫氰酸荧光素FITC ）标记的抗体及酶（碱性磷酸酶）标抗体结合形成“三明治”结构的复合物。随后加入连有抗荧光素抗体的磁微粒，通过抗荧光素抗体与荧光素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，通过光量子阅读系统记录光子能量，并通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度，并报告结果。 经典的双抗体夹心法，均采用两步法，即待测标本与酶标抗体分开加，两步温育。如果血清标本中有类风湿因子（RF）,则可出现假阳性反应。（因为RF是一种抗变性IgG的自身抗体，能与多种动物变性的IgG的Fc部分结合，因此RF就可作为固相抗体和酶标抗体之间的桥接抗原，与固相抗体和酶标抗体相结合。双抗体夹心法只适用于二价或二价以上的大分子抗原的测定，不能用于小分子半抗原的检测。） 磁微粒化学发光免疫分析示意图（双抗体夹心法）??? ●磁微粒化学发光--竞争法： 　　将待测抗原、用过量包被磁微粒的抗体和定量的标记抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合形成复合物；二是待测抗原与抗体结合形成复合物。如待测标本中含有待测抗原，则与标记抗原以同样的机会与磁微粒包被的抗体结合，竞争性地占去了标记抗原与磁微粒包被的抗体结合的机会，使标记抗原与磁微粒包被的抗体的结合量减少。由于磁微粒包被的抗体是过量的，足以与待测抗原结合。磁微粒在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，通过光量子阅读系统记录光子能量，并通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度，并报告结果。 倍爱康磁发光免疫夹心法 免疫反应 分离反应 夹心法 发光反应（磁发光） 显色反应（磁酶免） 竞争法 免疫反应 分离反应 竞争法 发光反应（磁发光） 显色反应（磁酶免） ●磁微粒化学发光—间接法： 　? 待测抗体与荧光素标记的抗原结合，随后加入包被着抗荧光素抗体的磁微粒，通过抗荧光素抗体与荧光素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直接沉淀，去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶标抗体，形成磁微粒－抗原－抗体－酶标二抗夹心免疫复合物。再次清洗后，加入酶促化学发光底物。