草鱼肠道组织消减cDNA文库构建及免疫相关基因克隆和表达分析.pdf

湖南农业太幸博士擘值论丈 草鱼肠道组织消减cDNA文库的构建及免疫榍关难W的克降’，表达分析 中文摘要 草鱼肠道组织消减cDNA文库的构建及免疫相关 基因的克隆与表达分析 鱼类生活在一个水体环境，其大面积的黏膜是病原感染鱼类时最先接触的 部位，它们产生的黏膜免疫反应是鱼类参与免疫应答过程的一个重要组成部分。 本研究通过人工灌注嗜水气单胞菌，采用抑制性消减杂交(SSH)的方法构建了 草鱼肠道组织差异表达消减cDNA文库，并对cDNA文库克隆进行了部分测序， 测序结果进行了同源性搜索和功能的分类。同时，对参与肠道组织免疫相关因 cDNA全长进行克隆、序列分析，探讨了它们在草鱼不同组织中的表达分布。这 些阶段性研究为进一步研究、阐释鱼类黏膜免疫机制积累了重要材料。本文的 研究内容和结果主要包括以下几个方面： 1．消减eDNA文库构建及其序列分析 采用抑制性消减杂交技术，构建了草鱼肠道组织在细菌诱导条件下和未诱 导条件下，两个不同生理状态的消减cDNA文库，随机挑取211个cDNA克隆 进行了单向测序，共获得有效cDNA序列147个。 序列同源性搜索结果显示，在147个有效cDNA序列中，有97个克隆与 列；17个与未知功能的序列有一定的同源性；33个序列在Blast搜索中没有找 到任何对应的相似序列，可能是没有鉴定的EST。97个已知功能的EST分别属 于46个不同的基因。 根据Adams对功能基因的分类方法，所获得EST分为8类，蛋白质与基因 表达、信号传导、细胞结构与运动、代谢、细胞防御、细胞分裂和其它未知功 能的蛋自，在本实验获得的EST分类，细胞防御类cDNA序列所占比例最高， 为序列总数的27．2％，其次为信号传导和代谢，分别为12．9％、12．2％，蛋白质 与基因表达为11．6％。细胞结构与运动、细胞分裂两者所占比例相对偏低，说明 在外源刺激的条件下，肠道组织细胞的防御、信号传导、代谢、蛋白质与基因 表达相关因子都有一定的表达上调，特别是与防御相关因子。 湖南农业走学博士擘位论丈 学鱼肠道组织消减eDNA空库的构建及免疫相关皋州的免隆’j表达分析 2．草鱼肠道免疫相关基因MHC．II旺的eDNA的克隆及序列分析 AceNo：EW688194)设计特 根据草鱼消减文库获得的EST序列(GenBank ot基因的全长eDNA 异性引物，分别用5-RACE和3-RACE的方法获得MHC—lI Aec 序列(GenBank cDNA序列的结构组成特点，结果表明，所获得的MHC．IIa基因eDNA全长为 ct基因eDNA 非翻译区256bp；在nt962—967有一个AATAAA加尾信号。由MHC—II 推断的氨基酸序列编码蛋白的等电点为4．92，分子量为26．4KDa。在序列的前部 分存在一个由20个氨基酸组成的信号肽，在第210．232位存在一个跨膜区。氨 基酸序列比较结果，草鱼MHC．IIn氨基酸序列与鲤鱼MHC—IIa相似性最高， 其次为斑马鱼，与比较的序列中的护士鲨相似性最低。系统进化聚类分析研究 表明，草鱼与鲤鱼、斑马鱼进化亲缘关系最近，与护士鲨、非洲鲷亲缘关系较 远。RT-PCR半定量分析组织中的表达分布，诱导后结果显示，MHC．IIa在脾脏、 头肾、后肠有较高的表达，在肝脏表达较低，在肌肉中几乎不表达。 3．草鱼肠道组织免疫相关基因Alpha-l-microglobulling 长eDNA克隆与序列分析 Ace No：Ew688152) 根据草鱼消减eDNA文库获得的EST序列(Genbank 为基础设计特异性引物，采用5’RACE和3’RACE方法，经拼接获得AMBP Aec 基因全长eDNA序列(Genbank 3’端存在2个不稳定的信号ATTFA和一个加尾信号AATAAA。生物信