基因重组白眉蝮蛇去整合素Adinbitor及周边序列定点突变体功能研析.pdf

基因重组白眉蝮蛇去整合素Adinbitor及其周边序列定 点突变体功能的研究 博士生姓名：胡燕荣 指导教师：赵宝昌 教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘． 要 本研究室从产于中国旅顺的白眉蝮蛇(Gloydiusblomhoffibrevicaudus) 毒腺中提取总RNA，利用自行设计的引物进行RT．PCR扩增，获得了 21 9bp的白眉蝮蛇去整合素基因。将去整合素基因进行克隆、转化与诱 导后，得到了该蛋白的可溶性高效表达。经组氨酸亲和层析纯化，获得 了分子量为9kD的均质蛋白，并将其命名为Adinbitor。经研究证实； Adinbitor具有去整合素的典型生物活性，即可以显著抑制血小板聚集和 血管新生。 本研究试图通过对去整合素Adinbitor结构的改造从而改变其功能。 (以下简称KGD突变体)，并证实其不具有抑制血管新生的功能而仅保 留抑制血小板聚集的功能…。本研究采用引物延伸PCR的方法获得了 对血小板聚集的影响很小。而据本室报道，野生型Adinbitor可显著性抑 lamoULt引。为进一步阐明该作用的分子机制， 制血小板聚集，其IC50为6 II 抗体与血小板膜糖蛋白整合素0【II l是a b133结合的影响。CD4 b133受体 的抗体，它可与静止及活化的伐II b133受体发生特异性结合。流式细胞仪 抗体与aIIbiB3的结合。这种抑制作用呈现出剂量依赖性。说明野生型 Adinbitor和KGD突变体可通过占据qIIb133位点，从而发挥其抑制血小 板聚集的功能。而在相同浓度下的RPT突变体的作用下，血小板聚集度 几乎没有变化，流氏细胞仪检测结果显示该突变体未明显影响CD4l抗 体与0【II 空间构象的改变，从而导致Adinbitor与仅IIb133的亲和力显著降低。而 Adinbitor均具有活化血小板的功能。 管新生功能，用体内实验进一步验证。采用鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic 模型。运用Imageproplus6．0软件计算新生血管面积与CAM开窗面积的 比值，该比值可以比较准确地表现血管新生的情况[31。本研究室已完成 行考察，研究结果显示：该突变体可以显著抑制CAM模型的血管新生， 血管数明显减少，血管面积与CAM开窗面积的比值随着剂量的加大而 减少，阴性对照为l 别为11．4％、9．4％、6．3％，呈现出剂量依赖性，说明该突变体仍保留有 抑制血管新生的功能。 本文还研究了三种Adinbitor对SSMC7721细胞株增殖、凋亡、黏附、 移的作用；MTT法检测Adinbitor对SSMC7721细胞增殖的作用； Hoechst33258试剂盒检测Adinbitor对SSMC7721凋亡的影响．Transwell 1细胞侵袭的影响。结果显示： 和Matrigel检测两种Adinbitor对SSMC772 三种Adinbitor均可以显著性抑制细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞的 生型Adinbitor所具有的这些生物活性。 为深入研究Adinbitor生物活性的分子机制，我们检测了野生型和 KB．Q表达增加， 0．051，促进凋亡。Akt的磷酸化受到抑制，而细胞浆内I 号转导分子的作用而抑制与Akt相关信号分子相关的一系列生物功能， 如增殖、迁移、侵袭、黏附等。 子机制，Western p．Caspase一3被剪切活化成为活性形式。同时活化程度增高，活化倍数在 影响Caspase．3而促进凋亡。 集的抑制作用，同时保留了其对血管新生、细胞迁移、增殖、侵袭、黏 附和凋亡的作用。以上生物学活性可能通过其对Akt信号通路的抑制而 实验。若将其开发成抗肿瘤药物，其最重要