应用实时荧光定pcr技术结合dna直接测序技术检测pink1基因突变.pdfVIP

应用实时荧光定量POR技术结合DNA直接 测序技术检测PINKI基因突变 摘要 背景 帕金森病(Parkinson’sDisease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，临床 表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常等，病理以黑质多巴胺能 recessive 有家族史。常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征(autosomal early-onset 式呈常染色体隐性遗传，发病年龄≤45岁的帕金森综合征；其发病可能与Parkin Reacted Dystonia，DRD)是指对小剂量左旋多巴有显著性和持续 碍(Dopamine 性反应的肌张力障碍，其主要致病基因为GCH-1基因和TH基因。由于DRD临 床表现可能与发病年龄更早的AREP相似：发病年龄早、有肌张力障碍等表现、 对多巴制剂反应良好，故有时两者在临床表现上难以区分，因此，基因诊断和分 子分型是必须的。 国内外研究者对PINKI基因进行突变分析，发现除点突变、小片段缺失或， 和插入突变以外，还发现捌艇f基因存在外显子重排突变。对于呈杂合状态的 外显子缺失突变及呈杂合或纯合状态的重复突变，DNA直接测序常常不能检 出，因此为全面检测P1NKl基因突变，目前国外普遍采用荧光定量PCR技术结 合DNA直接测序技术对PINKl基因进行突变检测。目前国内仅有张玉虎等用 DNA直接测序法对PINKl基因进行突变检测的报道，尚未见用实时荧光定量 PCR技术检测PINKl基因突变的报道。 目的 建立应用实时荧光定量PCR检测PINKl基因外显子重排突变的技术平台，结 基因突变分析。 方法 采用实时荧光定量PCR技术检测PINKl基因外显子重排突变，结合DNA直接 测序技术检测PINKl基因点突变、小片段插入或／和缺失突变。设置脚基因为 内对照，建立PINKl基因和舭口基因的标准曲线，根据已建立的标准曲线计算 PINKl基因和脚基因相对于标准品的起始拷贝数，PINKl基因相对拷贝数为 PINKl基因相对起始拷贝数与ALB基因相对起始拷贝数的比值。 结果 应用实时荧光定量PCR技术对21个AREP家系和6个DRD家系先证者进行 PINKl基因外显子重排突变检测，发现PINKl基因各外显子相对拷贝数均在 0．8-1．2之间，在目前公认的正常参考范围之内，提示本组患者不存在PINKl基 因各外显子的重排突变；在前期工作的基础上，应用DNA直接测序法对5个AREP 家系和3个DRD家系先证者进行PINKl基因点突变、小片段插入或／和缺失突交 结论 建立了应用实时荧光定量PCR检测PIN塘7基因岁}显子重排突变的技术平台， 未发现本组患者存在PINKl基因各外显子重排突变；发现了本组患者PINKl基 3’一UTR37a—t，均为已报道SNPs。 关键词 实时荧光定量PCR，AREP，DRD，PINKl基因，突变分析 II ABSTRACT disease is a common (PD) Background：Parkinson’S the and disorderwinlclinicfeatures neurodegenerative ofit in featureistheformationof dyskinesia．111epathology Lewybody ofthesubstantial