实时荧光定量pr检测npm1基因突变及表达的方法学构建与临床应用.pdfVIP

·中文论著摘要· 实时荧光定量PCR检测NPM基因突变及表达的方法 学构建与临床应用 背景与目的 急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)是一组在临床及遗传学上均高 度异质性的疾病，细胞遗传学和分子遗传学是影响AML患者预后最重要的独立 因素。常规染色体检查中50％60％的成人原发AML患者的治疗前骨髓中可检出 和inv(16)／t(16；16)等，与之对应的融合基因成为国际上公认监测微小残留病灶 (minimalresidual 上呈现为核型J下常，属中等预后组，这群在AML预后分组中所占比例最大的患 者预后变异较大，是否真的不存在遗传学异常，还是常规的检测手段不能发现问 题，寻找有助于进行核型正常AML患者预后分级的分子标志成为当今国际上的研 胞质的蛋白质，通过与肿瘤抑制因子ARF相互作用，参与P53活性和细胞周期的 调节，保持基因组的稳定。近年来发现，除M3外大约46％--62％核型正常的AML 中存在核磷酸蛋白NPMl基因第12号外显子的突变及其蛋白的胞浆移位，提示 NPMl突变在急性髓系白血病的发生、诊断及疗效监测等方面具有重要意义。本 研究以初诊患者作为研究对象，构建应用实时荧光定量PCR技术定量检测NPMl 中的发生率，观察其mRNA表达水平与细胞形态学，细胞遗传学，免疫表型等临 床特征的关系，初步探讨其作为监测白血病MRD指标的可行性及其在核型正常 AML患者的l临床诊断、预后分级等方面的潜在应用价值与意义。 方 法 对定量法，应用TaqMan探针技术，以管家基因ABL为内参，同时设置正常对照 和无模板对照；提取待测标本总RNA，测定其核酸浓度，进行10倍系列稀释后作 结束后，设定最佳阈值，荧光定量PCR仪给出曲线斜率及Ct值，计算目的基因的 相对表达指数，同时对方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。 2、对142例初诊为AML的成人患者骨髓标本进行FAB细胞形态学分型，常 规染色体核型分析及流式细胞术检测其免疫分型。骨髓增生异常综合症(MDS)和继 发性AML均不作为入选对象，10名健康捐献者骨髓标本作为对照。 3、提取AML及健康者骨髓标本总RNA，逆转录为cDNA进行实时荧光定量 PCR检测，应用逆转录PCR对定量PCR扩增产物进行确认。定量检测结果参照 标准曲线，得到NPMl一mutAmRNA的相对表达指数。 细胞数量及CD34表达的关系。 5、常规进行方差齐性检验、正态性检验。单变量两组资料之间的比较采用t 检验，多组资料之间的比较采用单因素方差分析，方差不齐者采用非参数检验， 计数资料使用卡方检验，以P0．05为差别有统计学意义。采用SPSSl2．0统计软 件处理分析。 结 果 量范围达1×1 0击数量级，且重复性好，管问、批间变异系数(coefficientvariation，CV) 分别为1．8％、2．1％。 、M6中占20．O％(1／5)。 2 的比例高于异常核型组(尸0．05)。 床特征(尸0．05)。 结 论 1、成功构建了实时荧光定量PCR检测AML患者NPM--mutAmRNA表达水 平的方法。 生率高，是目前常见的分子遗传学异常之一。 床特征。 4、NPM基因表达水平有可以做为核型正常的AML监测微小残留病变的指标 之一。 5、应用实时荧光定量PCR检测NPMl基因突变的方法简单可靠，易于在临 床开展，有助于初诊AML患者的辅助诊断及预后监测。 关键词 急性髓系白血病，核仁磷酸蛋白，基因突变，实时荧光定量，聚合酶链反应 ·英文论著摘要· Establishmentandclinical oftheDetection application Real ofNPMlGeneMutationstime b