基因工程,PCR等分子遗传学的应用精要.docVIP

奥赛辅导遗传第七节 PAGE PAGE 5 第七节 分子遗传及应用 一、基因工程概念 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于外源基因。除了少数RNA病毒外，几乎所有生物的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程亦称为重组DNA技术（DNA recombination）。另外，DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆或基因的无性繁殖（Molecular cloning）。 广义的基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义的基因工程）；而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。因此，广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。值得注意的是，广义的基因工程是一个高度统一的整体。上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想，而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现与保证，这是基因工程产业化的基本原则。 二、基因工程的基本过程 依据定义，基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分组成。前者主要在实验室里进行，其单元操作过程如下： （1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切）； （2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（简称接）； （3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称转）； （4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称增）； （5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）。 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检。 三、基因工程的基本原理 作为现代生物工程的关键技术，基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。为达到此目的，可从以下四个方面考虑： （1）利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达水平。这里涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理； （2）筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平； （3）选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件，强化受体细胞中蛋白质的生物合成过程。上述两点均涉及到基因表达调控的分子生物学原理； （4）基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物产量的主要环节，这里涉及的是生物化学工程学的基本理论体系。 因此，分子遗传学、分子生物学以及生化工程学是基因工程原理的三大基石。 四、基因工程的发展历史 从基本流程来看，基因工程的操作是很简单的，但其中涉及到许多关键性技术，如不同生物来源的DNA分子的切割与连接、DNA拼接反应的检测方法以及重组DNA分子导入受体细胞的方法等。有趣的是，这三项基本技术几乎是同时于七十年代初发展起来，并迅速导致了第一个DNA体外重组实验的诞生。 1．基因工程的诞生 1972年美国Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40 DNA、?噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。正如Cohen在评价其实验结果时指出的那样，基因工程技术完全有可能使大肠杆菌具备其它生物种类所固有的特殊生物代谢途径与功能，如光合反应和抗生素合成等。 出人意料的是，当时科学界对这项新技术诞生的第一个反应便是应当禁止有关实验的继续开展，其严厉程度远大于今天人们对人体克隆的关注。包括Cohen本人在内的分子生物学家们都担心，两种不同生物