DNA提取过程中所用试剂机理.pdf

1.溶菌酶的作用机制是 溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的 比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或 N-乙酰 胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中 N-乙酰胞壁酸与 N-乙酰氨基 葡萄糖之间的 β-1，4 键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保 护作用，最终使细菌溶解死亡。也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到 杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组 成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由 N-乙酰胞壁 酸与 N-乙酰氨基葡萄糖之间的 β-1，4 键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希 氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能保护婴 儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还 可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消 化吸收。 简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。 2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS ）常用于 DNA 提取过程中 使蛋白质变性后与 DNA 分开。 SDS 是分离 DNA 时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用： a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂； b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来； c. 对 RNase、Dnase 有一定的抑制作用； d. SDS能够与蛋白质结合形成R -O-SO - …R +-蛋白质复合物，使蛋白质变 1 3 2 性沉淀。 质粒提取常见问题 1．溶液 I—溶菌液： a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 β-1,4 糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中 pH 小于 8 时，溶菌酶作用受到 抑制。 b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械剪切力作用而 降解。 C. EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）; （2 ）EDTA的存在， 有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2 ．溶液 II－NaOH－SDS 液： NaOH：核酸在 pH 大于 5，小于 9 的溶液中，是稳定的。但当 pH＞12 或 pH＜3 时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液 II 中的 NaOH 浓度为 0.2mo1 ／L，加抽提液时，该系统的 pH 就高达 12.6，因而促使染色体 DNA 与 质粒 DNA 的变性。 SDS：SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂 质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2 ）解聚细胞中的核蛋白。（3 ） SDS 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而 沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必 须把它去除干净，防止在下一步操作中（用 RNase 去除 RNA 时）受到干扰。 3. 溶液 III--3mol ／L NaAc （pH4.8）溶液： NaAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至 4.8 ，必须加入大量的冰醋酸。所 以该溶液实际上是NaAc-HAc 的缓冲液。用 pH4.8 的NaAc 溶液是为了把 pH12.6 的抽提液，调回 pH 至中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而 高盐的 3mol ／L NaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及SDS-蛋白 复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合， 后者是因为钠盐与 SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物， 使沉淀更完全。 4 ．为什么用无水乙醇沉淀 DNA？ 用无水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的优点 是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全， 因此是理想的沉淀剂。 DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般实验中，是加