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第 五 章 分子生物学研究法 本章主要内容 一、重组DNA技术发展史上的重大事件 二、基因操作的主要技术原理 三、基因克隆的载体系统 四、基因的分离与鉴定 一、 重组DNA技术发展史上的重大事件 1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；2. 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；3. 50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 重组DNA技术历史上的主要事件 基因工程的主要内容或步骤: 　　1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。　　2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。　　3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。　　4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。　　5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 二、 基因操作的主要技术原理 1． 核酸的凝胶电泳 ??? 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 ??? 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。 　　在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。 2． 核酸的分子杂交技术 ??? 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地吸印 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。 核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：?? 将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法?? 将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。 3． 细菌的转化 ???　　 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。??? 对绝大多数hsdR-，hsdM-突变体菌株（k12），每ug DNA可得107-108个转化子。 4、分子克隆技术 （1）高质量mRNA的制备 ?? 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。 （2） 反转录成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase）；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA的方向性。 (四)限制性核酸内切酶的作用 大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况： 　　①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 为例： 　　5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp　OHTTAAC…3’ 　　3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3…　?CTTAAOH　 pG…5 ②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例： 　　5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp　OHG…3’ 　　3’…G↑ACGTC…5’P