人工锌指核酸酶的设计表达纯化.pdfVIP

中国生物工程杂志 ChinaBiotechn0l0g)r，2008，28(12)：36～40 人工锌指核酸酶的设计与表达纯化珠 蒋 泓 曾 芳 王克振 梁沂梅 李月琴 张细权。周天鸿 唐冬生 (1佛山大学医学院 佛山 528O0H0 2暨南大学生命科学与技术学院 广州 5lO632) (3华南农业大学动物科学学院 广州 5lO642) 摘要 设计表达了4个锌指核酸酶，用于切断人基因组中的 M 基 因家族的内部转录间隔序 列，造成双链断裂，以此提高针对多位点基因打靶的效率，为后续基因打靶应用于基 因治疗研究 奠定基础。首先，在人 基因家族 IrI1S1序列中找到2个合适的9bp长的序列(中间间隔6 bp)为锌指蛋 白识别位点，根据识别位点序列每个位点分别设计 2个三锌指蛋 白。通过设计引物 进行重叠延伸PcR得到全长编码锌指蛋 白的DNA，分别克隆到表达载体pET_28a(+)，构建重组 质粒pE 8a_zFP，转化大肠杆菌R0ssetta (DE3)，实现带组氨酸标签的锌指融合蛋 白的表达与 纯化。同时，将限制性 内切酶 Jj}I的切割结构域分别与4个锌指蛋白序列采用PCR拼接后克隆 到表达载体pET-28a(+)，构建重组质粒pET28a-ZFN，转化到大肠杆菌R0ssetta (DE3)，实现带 组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。 关键词 锌指核酸酶 设计 生物合成 表达 纯化 基因打靶 基因治疗 中图分类号 Q816 目前基因打靶技术主要应用于基因功能的研究、 达9bp～18bp的序列 J。l996年 Kim等发现，将已 研制人类疾病的基因治疗和研制动物生物反应器…。 知的识别特异 DNA序列的锌指结构与限制性 内切酶 但是基因打靶技术存在打靶效率低、容易受到随机插 ．j}I中无特异性识别作用的切割结构域通过一个 入的干扰等不足之处，这主要是 由于 目前基因打靶技 “linker”串联表达，可以组合成一个新的限制性内切 术的靶位点通常为单拷贝序列所造成的。DNA重复序 酶——锌指嵌合核酸酶(zincfingernuc1ease，zFN)，其 列被认为是外源基因整合的禁区，原因是重复序列处 识别和切割位点 由其 中的锌指结构决定。根据修复 通常无基因表达。然而前人研究表明，核仁组织区虽 DNA双链断裂 (doublestrandbreak，DsB)的主要途径 以重复序列为主，但其中的基因完全能表达。因此，可 是同源重组；反之提高 DsB也能一定程度上提高同源 以利用细胞核仁组织区存在的非编码 DNA重复序列 重组准确修复 DsB损伤几率的原理 娟。因此，可以 作为靶位点，建立多位点基因打靶技术 。多位点基 使用人工设计合成的锌指嵌合核酸酶来进一步提高多 因打靶技术虽然有将基因打靶效率提高200～3)【0倍、 位点基因打靶的效率。 无细胞毒性和易于表达等优点，但用于人类基因治疗， 本研究设计表达了4个锌指核酸酶，将其用于切 仍存在打靶效率较低和需要药物筛选等不足，尚需要 断人基因组中的 r，)M 基因的内部转录间隔序列 1 进一步改进。 (intemallransc edspacer1，ITS1)，造成DSB，以此进 由于锌指蛋 白(zinc6ngerpmtein，zFP)的特异性 一 步提高多位点基因打靶的效率，为多位点基因打靶 识别DNA等特点，人们开始关注并将锌指蛋白加以改 技术在基因治疗中的应用打下坚实基础。