wt1反义寡核酸对白血病微小残留病的体外净化作用.pdfVIP

中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所里交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：监趄日期：么、．【，』』’ 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： ，．～一一一～一～-、 L 中文论著摘要 ，} wTl反义寡核苷酸对白血病微小 残留病的体外净化作用 前 言 随着新化疗药物的应用以及造血干细胞移植等治疗方法的开展，急性 白血病的完全缓解率已得到很大提高，生存期明显延长，但完全缓解患者体 内存在的微小残留病仍是白血病复发的主要根源。造血细胞的增殖受多种 因子的调控，自血病的发生与基因的异常表达有关。Wj】ms瘤基因(WTl) 位于染色体11p13位点，是具有转录抑制和激活双重功能的调节因子，可能 作为调控造血细胞增殖和／或分化基因的转录抑制剂，在白血病的发生、发 ‘ 展及预后中起一定的作用。 反义寡核苷酸(AS0)是与mRNA互补的核苷酸序列，通过影响基因转 录、mRNA剪切及抑制mRNA的翻译等环节发挥特异性封闭靶基因表达的 作用。 本实验目的是通过wTl反义寡核苷酸抑制wTl基因的表达，观察微 小残留病模型及患者基因表达的变化，迸一步研究wTl基因在白血病发生 发展中的作用，探讨wTl反义寡核苷酸在白血病微小残留病反义治疗中的 应用。 实验材料 上述试剂均由传染病实验室提供。引物、寡核苷酸由Takara公司合成。 2．仪器：CO：培养箱、高速冷冻离心机、紫外分光光度仪、PCR扩增仪、 电泳仪、自动电泳凝胶成像分析仪、一152℃低温冰箱、一30℃低温冰箱。 实验方法 1．wTl基因阳性的白血病微小残留病模型的建立和培养 度用正常人骨髓单个核细胞分别与K562、HL60细胞系按比例配成白血病 微小残留病模型。 2．wTl基因阳性的急性白血病完全缓解(CR)患者骨髓的筛选 血病完全缓解患者中的表达情况，筛选出wTl基因表达阳性的骨髓标本。 3．wTl阳性细胞培养 筛选出的wTl阳性急性白血病CR患者骨髓细胞及白血病细胞系微 的RPMll640培养液中，于37℃，5％C0：，饱和湿度的培养箱中培养。 4．wTl反义寡核苷酸处理细胞 2×106／rnl wTl阳性急性白血病cR患者骨髓标本或白血病细胞系微 小残留病模型的细胞悬液接种于24孔培养板中，每个培养板内细胞悬液总 量为1 和对照组，分别加人等体积的wTl反义寡核苷酸、有义寡核苷酸及培养液。 寡核苷酸试剂的终浓度为120斗昏／血，先在初始浓度下培养24小时，以后每 24小时追加一次试剂(每次浓度60斗g／Inl)，共持续培养72小时。 5．wTl基因的结果检测： 72小时后收集培养板中各组细胞，采用RT—PcR进行wTl基因检 测。 实验结果 1．RT—PcR检测wT】基因的敏感