第二章动物细胞大规模培养和专用生物反应器资料.pptVIP

五、中空纤维生物反应器 用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。 优点： ●占地空间少； ●细胞产量高，细胞密度可达109数量级； ●生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。 板框式中空纤维反应器 液营养 中空纤维板 注意几个问题： (一)细胞培养环境 (1)氨离子：细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。 (2)乳酸：高乳酸浓度必将抑制细胞生长 (3)二氧化碳：二氧化碳积聚，对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。 (4)甲基乙二醛(Mc)：对细胞有潜在的损伤作用 (5)渗透压：恒定、适宜 (6)载体：可考虑采用多孔径载体替代容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。 (二)细胞死亡与凋亡 大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中死亡主要原因是细胞凋亡。 用基因工程方法将bcl—2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞，bcl—2基因的过量表达能抑制细胞凋亡，提高细胞密度和目的蛋白产量。 大规模动物细胞培养条件下，可通过“细胞静止”过程来降低营养成分消耗和代谢毒物产生。 (三) 培养基与细胞系 动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。 无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于产品纯化等不良影响。 在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。 (四)过程监控 测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间； 用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度； 测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷； 测定氧吸收速率估测ATP的形成； 测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等均得以应用。 测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般来说，呼吸商应接近1.0，这就要求细胞培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出。 用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质含量测定。另外，用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性。 计数法(细胞运输)　 当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买，也在国际交流，为此需要装运细胞的方法。 一种是用液氮或干冰贮存运输，需要特殊容器，较麻烦，且不适于长时间运行。另一方法为充液法，方便当行，是当前多采用的方法。?　 具体方法： 选生长状态良好的细胞，待培养近单层后，去掉培养液充满新培养液。液量要达培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞一吸塞，保留微量空气。空气留量过多，运输时大气泡来回流动　　对细胞有干扰作用。　　一般经4～5天运输对细胞活力无大影响。时间过长,细胞活力下降。到达后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液体量。置37摄氏度培养，次日传代。 十一 动物细胞体外培养举例 肿瘤细胞的体外培养与建系过程 体外培养肿瘤细胞的历史一定程度上代表了动物细胞体外培养的发展历史。 1952年，盖尔(Gey)首先成功地建立世界上第一个细胞系——子宫颈癌细胞的细胞系，并且使恶性肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细胞转向上皮源性细胞。 肿瘤细胞培养的发展成就主要体现在以下几个方面： (1)在培养的肿瘤细胞类型上，从间充质源性的细胞转向上皮源性细胞，再由神经外胚层源性到造血细胞源性的发展历程。 (2)在方法上，从原代培养到传代培养、再到细胞系的建立的发展过程。 (3)培养液成分上，由纯血清培养基到含血清、再到无血清培养基三个阶段。 (4) 生物学特性上，经历了从细胞水平到亚细胞水平，再到酶和分子水平的发展。 原代培养物经首次传代后，能在体外继续生长繁殖的细胞即为细胞系。然而，这并不意味着细胞能永久生长。可能过了若干代后，由于微生物污染、细胞分化成熟、细胞不适应外界环境等因素影响而丧失分裂能力。根据细胞分裂能力，可分为有限细胞系与无限细胞系两类。一般认为，如果细胞能在体外培养超过50代，培养时间超过一年，而且细胞的倍增时间保持稳定时，就可以认为建系成功。 人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系为例建系过程： (1)取材 (2)原代培养 (3)建系过程 组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长。2周后，可见成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快. 细胞在传代三次后 贴壁生长的细胞呈现上皮状。2周后细胞形成群落