第八章荧光分光光度法资料.pptVIP

第八章 荧光分光光度法 第八章 荧光分光光度法 分子荧光、磷光分析法的基本原理 介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度与被测物质之间的关系 荧光分析仪器 分子荧光定量分析 § 8- 1 概述 一、分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光 电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光--化学发光分析法 二、分子荧光分析法的特点 1. 灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度 2. 选择性好 不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长 不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长 比较容易排除其它物质的干扰，选择性好 3. 实验方法简单 4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广 具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用广泛。 § 8- 2 荧光和磷光光谱法 一、荧光和磷光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁产生荧光和磷光 基态分子 价电子跃迁到激发态 1. 电子自旋状态的多重性 大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的?? ，处于基态单重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱定律的。 若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态→激发三重态，净自旋 ? 0。这种跃迁为禁阻跃迁 T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态 分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激 2. 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括： 内部转换（IC）—相同的多重态之间的转换 S-S 系间窜跃（ISC）—不同的多重态之间的转换 S-T 振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程 外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭 发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内部转换困难 3. 荧光和磷光光谱的产生—辐射去激 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现象，这种过程叫辐射去激 S1或T1 S0 （2）磷光 当受激电子降到S1的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到T1振动能级，经振动驰豫到 T1最低振动能级，从T1最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光 从T1 ? S1要改变电子自旋，发光速度慢，约为 10-4 ~ 10s，光照停止后，磷光仍可持续一段时间 分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长 ? 磷 ? 荧 ?激 ? ? ?* 易产生荧光 n ? ?* 易产生磷光 二、荧光、磷光与分子结构的关系 了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体 （一）荧光效率 荧光强度常用荧光量子效率φf 来描述 荧光量子效率 ?f = 若以各种跃迁速率常数来表示 Kf 为荧光发射过程的速率常数——取决于物质的化学结构 ∑Ki 为非辐射跃迁的速率常数之和——主要取决于化学环境，也与化学结构有关 分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在0.1~1之间 至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧