stat1特异sirna真核表达载体的构建及其对16hbe细胞中stat1蛋白表达的影响.pdf

中STATl蛋白表达的影响 摘 要 被发现的转录因子，参与IFN的信号转导过程，为先天性免疫所必需。 参与细胞因子介导的信号转导过程，导致气道的炎症和高反应性，而支 气管哮喘气道炎症常与气道上皮细胞STATl途径的信号传导异常有关。 本研究通过设计针对STATl的发夹样RNA干扰重组体，用脂质体转染 蛋白表达的影响，检测其干扰活性，为探讨支气管哮喘等炎症性疾病的 基因治疗奠定基础。方法：本研究分两部分进行：1．STATl特异性siRNA 体的共同核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计双链siRNA，最 后选择两条片段作为STATl基因干扰片段；另设计一条由任一个片段随 机重排而成的阴性对照；再分别转化为能表达其shRNA的互补DNA序 列，经退火形成双链，将其连接到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋 取质粒，用SacI进行限制性酶切鉴定并做测序分析。构建的重组质粒分 性siRNA真核表达载体对l6HBE细胞中STATl蛋白表达的影响：采用重 并设空白对照组，共六组，在转染后24、48、72h观察细胞形态变化及 荧光表达，鉴定其不同条件下的转染效率；分四个组用IFN．Y刺激16HBE 2 4 0min、1h、2 细胞，分别在刺激后0min、3 h提细胞总蛋白，采 用Western 0 IFN．Y刺激3 8h提取细胞总蛋白， pGSTATl．2组、和阴性对照pG．HK组，在转染后4 用Westem 干扰重组体的活性。实验数据采用SPSSl3．0软件作统计学处理，进行单 因素方差分析和随机区组设计的方差分析，多个样本均数之问的多重比 较用LSD法，以P0．05表示差异有统计学意义。结果：通过酶切鉴定和 及一个阴性对照pG．HK连接正确，并成功转染到16HBE细胞中。采用 转染组转染效率最高，达58．21％(P0．01)，通过Westernblotting检测：发 计学意义(仁O．53 =O．0 1)，同时也明显低于pGSTATl．1组(尸=O．04)3pGSTATl．1抑制率达 的选择不同至所构建的质粒干扰活性不同。4．以STATl为靶点的RNA 干扰技术可望成为哮喘等气道炎症性疾病基因治疗的新方法。 6HBE) 皮细胞(1 siRNA Constructionof Vectorof EukaryoticExpression Specific of forSTATlGeneanditsinfluenceon STATI expression protein in16HBEcells transducerandactivatorof Abstract：Objective：Signal transcriptionl foundedinSTATfami a factorthat (STAT1)istranscription firstly ly,which in transductionof innate Participatesignal Interferon(IFN)andregulate