斜带石斑鱼抗溶弧菌单链抗体scfv的构建及活性检测.pdfVIP

斜带石斑鱼抗溶藻弧菌单链抗体ScFv的构建及活性 检测 摘要 近年来，单链抗体技术的发展非常迅速，并被广泛地应用于人类疾病的研究 中，但是在水产领域中的应用却鲜有报导。本论文的目的是构建斜带石斑鱼抗溶 藻弧菌单链抗体，并对其原核表达产物与溶藻弧菌的结合活性进行检测。本实验 设计引物所用的序列来自实验室构建的经溶藻弧菌感染后的斜带石斑鱼外周血 淋巴以及头肾SmartcDNA文库，经测序后发现的大量的免疫球蛋白重链与轻链 的基因，这为斜带石斑鱼抗溶藻弧菌单链抗体的构建提供了丰富的材料，通过对 测序得到的免疫球蛋白可变区序列进行分析，根据其可变区的框架一区(FRl) 和框架四区(FR4)筛选出一类丰度较高的重链的可变区(VH)与轻链的可变区 (vo基因序列，并分别按照这两类序列的框架一区(FRl)和框架四区(FR4) I和XhoI 设计引物进行VH、VL的扩增，在VH的5’端、VL的3’端分别加上Nde 符合鱼类免疫球蛋白可变区基因的特征，含有框架区(F飚)、抗原互补区(CD黜) 以及免疫球蛋白特征性的半胱氨酸残基，证明ScFv基因构建成功，于是用该质 行了表达，结果显示在三个温度下ScFv均以包涵体的形式进行表达，分子量为 24．8kDa；所得蛋白纯化后，用ELISA进行抗原结合活性检测其效价为l：3200； 随后再用表达的ScFv蛋白与佐剂混合后对体重约2kg的新西兰大白兔进行免疫 制各多克隆抗体，免疫程序结束后抽血并分离血清，检测血清中抗ScFv的多克 隆抗体的效价为1：10000． 本实验成功构建了斜带石斑鱼抗溶藻弧菌单链抗体ScFv，并成功进行了原 核表达以及表达产物的纯化，用ELISA检测了ScFv与抗原(溶藻弧菌)的结合 活性，其结果显示ScFv与溶藻弧菌有良好的结合活性；随后制备的兔抗ScFv 的多克隆抗体经ELISA检测显示出ScFv还具有良好的免疫原性。以上的研究为 ScFv作为基因工程疫苗以及作为溶藻弧菌的特异性探针等实际应用奠定了基 础。 关键词溶藻弧菌，单链抗体，基因工程疫苗 andcharacterizationof Construction the chain single variable of of fragmentantibody orange—-spotted grouper(Epinepheluscoioides) Vibrio againstalginolyticus Abstract Inrecent onthe had years，researchessingle-chain antibodydevelopedrapidly, which intheresearchofhumandisease．Butthe in widelyapplied research pertinent the is scarce．Inthe screenalotof aquaculturerelatively presentstudy,We Chain Heavy and