空肠弯曲菌chy,ciab,dnaj,cfra基因的克隆及其真核表达载体的构建.pdfVIP

中文 英文 研究 综述 致谢 个人 中文摘要 i 空肠弯曲菌cheY，caB，dnaJ，cfrA基因的克隆及其真核 表达载体的构建 摘 要 是引起急性胃肠道感染的主要病原菌之一。同时，空肠弯曲菌还与人类急 重要病因。近年，分子生物学技术以及基因工程技术得到了长足的发展， 使得人们对空肠弯曲菌在分子生物学方面的机制有了深入的研究，特别 NCTCll 是2000年公布了Cjejuni168(pemerO：2血清型)的全基因组序列 以来，使得研究C．jejuni在分子水平的致病机制方面有了新的前景。空肠 弯曲菌的致病机制主要包括侵袭、粘附、定植、产毒素，以及分子模拟等 方面。已有研究表明，多种毒力因子共同参与空肠弯曲菌的致病过程。 目的：本研究从基因水平出发，应用本地区已经证实的具有致吉兰一 O：19 巴雷综合症特性的空肠弯曲菌血清型pe皿er 1ulei菌株，选择该菌株 中具有侵袭、粘附、定植及产毒素等特性的14个致病相关基因进行TA NCTCll 克隆，经测序后，与Genebank中Cje：juIli 168中的相应基因进行 比对分析，观察相似性。再选择14个基因中，保守性、免疫原性相对较 强的4个基因进行克隆，并插入真核表达载体pEFneo．myc，获得真核表 达，为空肠弯曲菌基因工程疫苗的研制打下基础。 方法：扩增目的基因 O：19 以C．je：iunipellllerlulei菌株为模板，用 14个目的基因。 cdtC、peb2、pebC、ci招、dnaJ、cfIrA TA克隆 将14个目的基因分别连接到pGEM．TEasy载体，完成 对质粒进行酶切后凝胶电泳检测及测序鉴定。应用DNASTAR软件与 O：19 C．jejunipelulerlulei菌株DNA序列及NCTCll168中的相应基因进行 比对分析，得到相似指数。 中文摘要 构建真核表达载体 选择14个目的基因中，保守性、免疫原性较强 PCR的方法扩增4个基 的4个基因cheY、ciaB、dnaJ、cm～，用Pyrobest I和 因后，应用真核质粒载体pEFneo哪yc，以KpnI和EcoRV，或Kpn I为酶切位点，分别构建真核表达载体。经转化大肠杆菌感受态，得 Spe 到质粒并测序成功后，转染293T细胞。转染成功后用W．estem B10tting的 方法检测蛋白的表达。 片段长度太大，将其分成两段进行扩增并TA克隆。转化大肠杆菌感受态 并培养后，所得质粒经凝胶电泳检测，并测序鉴定后，应用DNAS吖浪 O：19 1 软件与C．硒unipennerlulei菌株DNA序列及NCTCll68中的相应 O：19 基因进行比对分析。所得目的基因与C．iejunipe衄er 1ulei菌株DNA NCTCll 序列相同；与C．jeiuni 168比对，得出结果：基因d11水、cheW、 为89．9％，cf认．2的相似指数50％。应用真核质粒载体pEFneo．myc，成 功构