第2章-3.ppt

分离系统（色谱柱） 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。最常用的分析型色谱柱是内径4～6mm，长100～300mm的内部抛光的不锈钢管柱．内部填充5～10μm粒的球形颗粒填料。不同的物质在色谱柱中的保留时间不同，依次流出色谱柱进入检测器。 检测系统（检测器） 检测器（作用）是用来连续检测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化实现分离的核心部件的装置。它利用被测物的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当被测物从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式表现出来 。 常用的检测器 ： 1)紫外-可见光检测器（UV-VIS） 原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。 2)示差折光(折射指数)检测器 检测器是一种通用型检测器。它的作用原理是纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同，检测器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。 3)荧光、化学发光检测器 利用许多有机化合物被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出荧光的特点进行检测。 化学发光的原理是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态的反应中间体或中间产物，当它们从激发态返回基态时发射出光子，因为物质激发态的能量来自于化学反应，故称化学发光。 4）电化学检测器 利用物质的电活性，通过电极上的氧化或还原反应进行检测。 附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。 梯(强)度洗脱：在色谱图中，如先出峰的组分峰间距较大，而后出峰的几种组分不能完全分离，则可先用强度大的流动相洗脱，中途减小强度。这样前边的峰距缩小。后面的峰距加大，所有的峰排列更均匀。如果出峰情况与上述相反。则可采用先弱后强的方法。这种分离过程中改变洗脱溶剂强度的方法称为梯(强)度洗脱。而不改变溶剂强度(即组成)的方法称为等(强)度洗脱。梯度洗脱通常是靠改变混合淋洗剂的组成比例来调整洗脱强度的。 液相色谱 * * 高效液相色谱分析法 HPLC （High Performance Liquid Chromatography） 液相色谱：液体为流动相的色谱方法。 早期液相色谱，都是是用大直径（直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法。此方法柱效低(流速1mL/min)、时间长（常有几个小时）。 高效液相色谱法 ：在经典液相色谱法的基础上，于20世纪60年代后期引入气相色谱理论，尤其是在速率理论的指导下，填料制备技术、柱填充技术、高压输液泵制造及化学键合型固定相制备等方面得到高速发展，使液相色谱分离实现了高速度。现在，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称作高效液相色谱。 它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法。又因分析速度快而称为高速液相色谱法。也称现代液相色谱。 高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 高效液相色谱法的特点 一、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测。 占有机物的20%。 HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 。 用途广泛，占有机物的80%。 2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流